定点突变老是不成功咋办？

想把几个点突变成丙氨酸，设计引物，pcr，消化转化感觉都没有问题，最后长出来的菌测序结果显示没突变成功，还是原来的模板，消化酶换成最新买的了，时间也加长了，还是不对，也问了组里的师兄师姐，没发现问题，想请问大家可能的原因出在哪