氨苄青霉素是一种常用的抗生素，其检测方法的选择对于保障药品质量至关重要。在现代分析技术的支持下，氨苄青霉素的检测方法日益多样化和精密化。
简述：氨苄青霉素(ampicillin，Amp)是β-内酰胺类抗生素的一种，是在青霉素G侧链羧基α位引入氨基，改变其极性的半合成青霉素，结构见图。氨苄青霉素耐酸不耐酶，克服了天然青霉素不宜内服的缺点，因此在畜牧养殖过程中常作为消炎抗感染的首选药物，对革兰氏阴性菌和阳性菌均可产生不同程度的抑制作用。
检测方法：
1. 分光光度法
分光光度法可用于测定低浓度的化合物和极少量的样品。2011 年 Khan A A P 等人介绍了测定氨苄青霉素( AMP) 两种简便、灵敏的动力学方法。第一种方法是基于药物与碱性高锰酸钾在室温下固定时间 25 min 氧化反应的动力学研究。在610 nm处测量着色的锰酸盐离子的吸光度。转移 5～30 μg/mL的 AMP 到一系列 50 mL 容量的烧瓶。向每个瓶添加 1 mL0．5 mol/L的氢氧化钠和 2 mL 5×10－3mol/L 的高锰酸钾，搅拌均匀，用水稀释到容量瓶刻度线，静置 25 min。在环境温度( 25 ℃) 下每隔 5 min 测量一次 610 nm 处的吸光度。
第二种方法是在 0．1 mol/L 的碳酸氢钠的存在下，AMP 与 1－氯 －2，4－二硝基苯( CDNB) 发生反应。通过记录 60 min 固定时间的吸光度( 波长 在 490 nm 处) 来 实 现 分 光 光 度 测 量。转 移 50 ～260 μg/mL的 AMP 到一系列 10 mL 容量烧瓶。每个烧瓶加入2 mL 5×10－3mol/L 的 CDNB，加入 0．2 mol/L 的硼酸盐缓冲液并摇匀，用蒸馏水稀释至容量瓶刻度线，静置 60 min，在室温( 25 ℃) 下，测量 490 nm 处的吸光度。两种方法都考察了影响显色的所有变量，并优化了显色条件，以吸光度对质量浓度的曲线在5～30 和50～260 μg/mL 范围内呈直线，平均回收率分别为99．80%和 99．91%。该方法已成功地应用于散粉及胶囊制剂中AMP 的测定。
2. 比色法
比色法是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。2017 年 Kamlesh Shrivas 等人研究开发了一种比色传感探针柠檬酸修饰的银纳米粒( AgNPs) 用于选择性检测尿液样本中氨苄青霉素。以柠檬酸三钠为包裹剂，用NaBH4 还原 AgNO3，用湿法化学方法合成柠檬酸盐包裹 AgNPs( 如下图所示) 。
3. 色谱法
在生物分析领域，诸如微生物抑制试验和免疫分析等多种方法已广泛应用于单独检测青霉素，但通常情况下，色谱法被视为解决混合抗生素的首选技术。液相色谱（LC）是用于药物制剂和生物材料中药物检测最为常见的色谱技术。2004 年 S．Bogialli 等人提出了一种测定牛肌肉、肝脏、肾脏和牛奶中两种青霉素( 阿莫西林和氨苄青霉素) 简便、特异、快速的测定方法。该方法以基质固相分散技术为基础，采用液相色谱串联质谱联用技术( LC－MS/MS) 进行检测。利用该技术对每个分析物采用两个裂解反应的高选择性监测采集模式。水浸液酸化过滤后，将25μL 的生物组织终提取物和 50 μL 的牛乳终提取物注射到 LC 装置中进行测定。在生物组织和牛奶中目标化合物的相对回收率在 100%～106%，RSDs 不大于 11%。检出限( LOD) 为 0．1×10－9( 牛奶中) ，0．5×10－9(组织中) ； 定量限( LOQ) 为 0．2×10－9(牛奶中)，0．8×10－9(组织中)。
4. 表面增强拉曼光谱法
表面增强拉曼光谱法( SEＲS) 具有原位取样、无损检测、灵敏度高和操作简便等优点，故广泛应用于多种青霉素类抗生素的检测和鉴别。2019 年李轩等人以氨苄青霉素为模板分子，3－( 异丁烯酰氧) 丙基三甲氧基硅烷( MPS) 为硅烷化试剂，甲基丙烯酸( MAA) 为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯( EGD－MA) 为交联剂、2，2－偶氮二异丁腈( AIBN) 为引发剂，制备了AMP 分子印迹聚合物( Ag@ MIPs)。以 Ag@ MIPs 作为基底，使用激光共聚焦拉曼光谱仪在 638 nm 对 AMP 进行检测。结果表明 Ag@ MIPs基底对较强的表面增强拉曼光谱( SEＲS) 有效果，增强因子可达 3．79×10 5 。对 AMP 浓度和 SEＲS 特征峰强度作线性拟合，发现其具有较好的线性关系，相关系数 Ｒ 2 为 0．959，对AMP检出限达到 1．0×10
－8mol/L。竞争吸附实验结果表明Ag@ MIPs 对 AMP 具有较高的选择性。该基底在检测氨苄青霉素时具有快速、灵敏、选择性强、重复性高等优点。
5. 荧光法
近年来，荧光法在生物分子检测领域备受关注，其简便、经济、快速响应和高灵敏度等优势使其成为最受青睐的分析方法之一。特别是在AMP检测方面，荧光法近年来得到了迅速发展，方法逐渐趋于成熟。2020 年 Fu 等人采用 Fe3+猝灭 CDs( 蓝色荧光的碳点) 集成系统( CDs+Fe3+)作为荧光探针，选择、灵敏地检测水中的氨苄青霉素。该方法以对二甲苯和水合肼为前驱物，以无水乙醇和超纯水为溶剂，采用简单的水热法制备了蓝色发射碳点( CDs)。CDs 表面有大量的羟基(－OH) 、氨基(－NH2) 和羧基(－COH) ，为金属离子提供了坐标点。加入氨苄青霉素后，Fe3+与氨苄青霉素的配位性更强，可以减弱 Fe3+与 CDs 的相互作用，使 CDs 荧光恢复，以达到检测目的。对氨苄青霉素的检测极限为 0．70 μmol/L，CDs+Fe3+络合物已成功应用于河水、自来水、矿泉水、牛奶和猪肉中氨苄青霉素的检测。
参考文献：
[1]刘里，董建伟，杨蒋美. 氨苄青霉素测定方法的研究进展 [J]. 山东化工， 2022， 51 (15): 74-82. DOI:10.19319/j.cnki.issn.1008-021x.2022.15.056.
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[3]张岩蔚，张冬昊，李佳仪等. 氨苄青霉素残留免疫学检测方法研究进展 [J]. 中国兽医杂志， 2018， 54 (06): 82-86.
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