Anti-FITC抗体的应用及其检测原理？ ¹

背景^[1-3]

Anti-FITC抗体是一类可以特异性结合FITC的单克隆抗体，主要用于检测FITC的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。

检测原理：双抗体夹心法测定标本中FITC水平。用纯化的FITC抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入FITC，再与HRP标记的FITC抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的FITC呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中FITC浓度。

FITC形态为黄色粉末，有吸湿性，是一种生化试剂，也是医学诊断药物，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。

并且它能与各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中仍有强烈绿色荧光，加酸后析出沉淀，荧光消失，微溶于丙酮、乙醚和石油醚。

FITC是生化试剂,也是医学诊断药物,主要用于荧光抗体技术中的荧光染料,能和各种抗体蛋白结合,结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性,并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。用于医学,农学和畜牧等方面,可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。

应用^[4][5]

用于灰树花多糖的FITC荧光标记及Caco-2细胞模型对其的吸收与转运研究

对灰树花多糖进行荧光标记,并通过Caco-2细胞模型对其吸收与摄入展开研究,为GRN的药代动力深入研究提供帮助。

首先,通过Sevag及分步沉淀等方法完成GRN初步纯化,再经DEAE-纤维素和Sephadex G-100凝胶柱层析纯化得到GRN纯品,经苯酚-硫酸法测定纯化后多糖含量为95.7%。其次,利用GRN末端的还原性与酪胺(Tyr)完成还原胺化反应,膜分离去除过剩Tyr等小分子,获得纯化的GRN-Tyr共价偶联物,再利用GRN-Tyr中Tyr的氨基基团与异硫氰酸荧光素(FITC)进行亲核反应,完成GRN荧光标记,最后通过Sephadex G-100柱层析获得纯化的GRN-Tyr-FITC。

通过苯酚硫酸法跟踪检测每步反应的产物糖原含量;PAGE电泳比较各反应产物迁移率(Rx);紫外光谱扫描跟踪反应产物是Tyr280nm、FITC490nm的特征吸收峰;荧光光谱扫描合成后的GRN-Tyr-FITC最佳激发波长与发射波长。计算GRN-Tyr-FITC中FITC的取代度,并对其进行稳定性实验。结果表明GRN-Tyr、GRN-Tyr-FITC二次标记成功;GRN-Tyr-FITC可以荧光定量检测(Ex:490nm,Em:520nm),尽管其最佳激发波长、最佳发射波长均有细微红移;GRN-Tyr-FITC可在避光4°C条件下稳定保存30天;分批合成的GRN-Tyr-FITC取代度达0.039%~0.060%(W/W)。最后,选用Caco-2细胞Transwell单层培养模型,可快速模拟肠道吸收转运多糖能力。

体外建立Caco-2细胞单层培养模型,并通过检测跨膜电阻(TEER)、显微形态观察及标志物渗漏方法保证其完整性和紧密性。

参考文献

[1]Effects of Taishan Robinia pseudoacacia Polysaccharides on immune function in chickens[J].Man-fei Liang,Guan-hua Liu,Qing-you Zhao,Shi-fa Yang,Shi-xun Zhong,Guo-lin Cui,Xiao-hua He,Xue Zhao,Fan-xia Guo,Cun Wu,Rui-liang Zhu.International Immunopharmacology.2013(4)

[2]Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport[J].Per Artursson,Katrin Palm,Kristina Luthman.Advanced Drug Delivery Reviews.2012

[3]Activation of macrophages by polysaccharide isolated from Paecilomyces cicadae through toll-like receptor 4[J].Hyung Sook Kim,Yeon Jin Kim,Hong Kyung Lee,Hwa Sun Ryu,Ji Sung Kim,Mi Jung Yoon,Jong Soon Kang,Jin Tae Hong,Youngsoo Kim,Sang-Bae Han.Food and Chemical Toxicology.2012(9)

[4]Anticancer polysaccharides from natural resources:A review of recent research[J].Aizhen Zong,Hongzhi Cao,Fengshan Wang.Carbohydrate Polymers.2012(4)

[5]丁涛.灰树花多糖的FITC荧光标记及Caco-2细胞模型对其的吸收与转运研究[D].江苏师范大学,2014.