在这篇文章中，我们将探讨使用腈水解酶的有效合成路线，用于制备(R)-(-)-2-氯扁桃酸。这种方法不仅具有实践价值，还对于生物催化和手性化合物合成的相关领域有着潜在的应用和发展前景。
背景：腈水解酶是一种能直接催化腈水解反应，转化为相应羧酸和氨的酶。而腈水合酶，先催化腈水解生成酰胺，再在酰胺酶的作用下，进一步水解生成羧酸和氨。在自然界中，腈水解酶来源广泛，主要有细菌，丝状真菌，酵母，植物等，并以细菌为主要来源。
近年来，合成工艺主要是利用手性砌块进行不对称合成技术，其中(R)-邻氯苯甘氨酸和(R)-(-)-2-氯扁桃酸((R)-2a)为主要的手性砌块，由于邻氯苯甘氨酸的拆分比较困难，故利用(R)-2a来进行不对称合成氯吡格雷成为最具竞争力的合成方法，其合成氯吡格雷的方法已较为成熟。在众多(R)-2a的合成路线中，腈水解酶法具有转化率高，立体选择性强，反应条件温和，原子利用率理论高达100%的优点，是非常具有应用前景的合成路线。
合成：
1. 腈水解酶法
腈水解酶法是直接催化腈水解、一步生成羧酸及氨的方法，腈水解酶具有高度化学、区域和立体选择性。目前关于立体选择性腈水解酶的报道很多，但是能作用于芳基乙腈类的不多，已有研究表明，粪产碱菌、恶臭假单胞菌等能够产生立体选择性的腈水解酶，作用于外消旋扁桃腈，水解生成(R)-扁桃酸，并且产物的e.e. 值都较高。但是以扁桃腈苯环上邻位取代的衍生物作为底物的研究报道则很少。
2. 腈水解酶的水解机理
腈水解酶的水解机理如图所示，腈水解酶的活性中心是由Glu-Lys-Cys构成的催化三联体。首先腈水解酶催化三联体中的半胱氨酸残基亲核进攻氰基的碳原子形成 酶与底物的复合物，在谷氨酸残基的作用下脱去一个氨，再结合第二个水分子，释放产物羧酸并使酶再生。由于腈水解酶的催化三联体活性中心不含金属离子，因而大部分金属离子螯合剂(如EDTA)对酶活没有抑制作用，而能够与巯基发生反应的金属离子 (Ag+、Cu 2+)则会显著抑制酶活。
3. DeSantis等通过直接提取环境中的DNA，创建了基因文库， 对该基因文库进行筛选，得到200多种腈水解酶。将这些腈水解酶用于混旋扁桃腈的水解，发现其中 27种具有水解活力，对其中活力最高的腈水解酶Ⅰ进行底物特异性研究，发现可作用于邻氯扁桃腈，得到(R)-邻氯扁桃酸，e.e.为97%，但是酶活力不高， 机理见图。
4. De Santis又对腈水解酶进行基因克隆，提供了设计使用新腈水解酶的方法，并提高了酶在较高pH值和温度下的活性和稳定性。Sakamoto等发现了一种新的腈水解酶以α-羟酸酯为底物，用于高效生产光学活性的α-羟酸，可用于合成 (R)-扁桃酸及其衍生物(R)-邻氯扁桃酸。其中对于邻氯扁桃酸烷酯有较高的选择性，可简单大规模制备，而且该酶还有杰出的特性，不对称水解反应在高浓度底物中可高效地进行，与其它微生物细胞或微生物培养物来比较更能耐受底物。国内研究方面，郑裕国等以粪产碱杆菌培养获得的腈水解酶为催化剂，得 到(R)-扁桃酸及其衍生物(R)-邻氯扁桃酸。产物e.e.值高达99%以上，并且可将外消旋底物全部转化为产物，该方法具有相当大的应用潜力。
5. 腈水解酶制备(R)-邻氯扁桃酸原理
利用腈水解酶制备(R)-邻氯扁桃酸的原理如图所示：碱性反应条件下，腈水解酶将(R)-2-Cl-MN水解生成(R)-邻氯扁桃酸 ；于此同时(S)-2-Cl-MN 在碱性条件下，通过中间产物邻氯苯甲醛和氢氰酸可以转化成(R)-2-Cl-MN。因此在反应过程中，随着 (R)-2-Cl-MN逐渐被腈水解酶水解而消耗，导致(R)-底物的浓度始终低于(S)-底物的浓度，进而引发底物的自消旋，使得两种底物的浓度趋于一致，最终所有底物均被腈水解酶水解生成产物(R)-邻氯扁桃酸。因此利用腈水解酶催化2-Cl-MN理论上能使得产物(R)-邻氯扁桃酸的产率达到100%。
参考文献：
[1]陈晨. 腈水解酶催化制备光学纯（R）-邻氯扁桃酸[D].湖北大学,2017.
[2]施成赐. 腈水解酶改造及在(R)-邻氯扁桃酸生产中的应用[D].浙江工业大学,2015.
[3]钱晶,徐赛珍,薛亚平等.(R)-邻氯扁桃酸的制备技术进展[J].化工进展,2011,30(02):396-401+406.DOI:10.16085/j.issn.1000-6613.2011.02.010.
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