D-荧光素是一种依赖腺苷三磷酸（ATP)生物发光反应的底物。生物发光的原理是荧光素在ATP和氧存在条件下被荧光素酶氧化。荧光素/荧光素酶的生物发光反应常用于ATP、能转化为ATP的代谢物和能产生ATP的酶的检测，因此生物发光反应可应用于广泛范围内生物材料的检测。
近几十年来，ATP生物发光技术在细胞增殖、细胞毒性和生物量计数等方面得到了广泛应用。在食品卫生领域，ATP生物发光技术具有操作简便、灵敏度高、快速获得结果等优势，是目前检测微生物最快的方法。此外，荧光素酶基因在分子生物学上也有广泛的应用。因此，D-荧光素作为生物发光反应的底物，具有很大的市场前景和科学意义。
一种制备高纯度D-荧光素的方法是通过2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑和盐酸吡啶进行高温脱甲基反应，然后提取脱甲基反应产物，经柱层析纯化，最后与D-半胱氨酸进行缩合反应生成D-荧光素。纯化即得D-荧光素产品。该方法在充氮气的条件下，2-氰基-6-羟基苯并噻唑与D-半胱氨酸在碱性条件下进行缩合反应，反应完毕后在充氮气的条件下用有一定极性的非水溶性有机溶剂进行萃取，萃取后的水相用盐酸进行酸化，分离沉淀物，沉淀物用溶水性有机溶剂进行洗涤，离心去上清，沉淀物真空干燥，即获得高纯度D-荧光素产品。
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