构建质粒测序结果总是有一个位点发生了突变是怎么回事？

求助，我前后换用了多个模板cdna构建质粒，都是同一位置碱基发生了突变，氨基酸也改变了，不应该是酶和引物的问题，有没有大神知道是怎么回事（也有没有比对序列一致的，但大多数都是同一位点发生了突变）
另外老板让我查突变位置的蛋白功能有没有改变，请问怎么查这个氨基酸在蛋白质上的功能呢