乙酰辅酶A羧化酶(ACC)测试盒微量法测定操作：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。
2、 酶促反应试剂的配制和预热：在试剂二瓶中加入 2.5mL 试剂一，充分溶解混匀；在试剂
三瓶中加入 2mL 蒸馏水，充分溶解混匀；将试剂一、二、三在 37℃(哺乳动物)或 25℃
(其它物种)预热 10 分钟。
3、定磷试剂的配制：按 H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂
应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂 用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七 20 倍稀释，即取 0.5mL 试剂七加 9.5 蒸馏水，充分混匀。
5、酶促反应
试剂名称（μL） 对照管 测定管
试剂一 90
试剂二 50
试剂三 40
样本 10 10
37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 30min 后，90℃水浴 5min（盖紧，以防止
水分散失），冷却后，10000g 25℃离心 5min，取上清
6、定磷
标准管 空白管 对照管 测定管
0.5μmol/mL 标准磷应用液 20
蒸馏水 20
上清液 20 20
定磷试剂 180 180 180 180
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）保温 30min，冷却至室温，在 660nm 处，蒸
馏水调零，记录各管吸光值 A。标准管、空白管只要做一次即可，每个测定管需要设一个对
照管。
注意：若测定管吸光值大于 2，将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定，使吸光值小于
2，可提高检测灵敏度，计算公式中乘以相应稀释倍数。
计算公式：
1、按组织蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC (μmol/h/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷
(V 样×Cpr)÷T=10×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
定义：每小时每 g 组织产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC (μmol/h /g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）×V 总÷
(W× V 样÷V 样总)÷T=10×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
3、 按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每 500 万细菌或细胞产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC (U/104
cell)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）×V 总÷
(500× V 样÷V 样总)÷T=0.02×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)
C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.1mL；V 样：加入样本体
积，0.01mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白
质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
