T4多聚核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK）是一种多聚核苷酸5' 羟基激酶，具有催化ATP的γ位磷酸基团向DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移的能力。它还可以催化5'-OH+NTP→5'-P+NDP的反应。此外，当缺失ATP并且存在ADP时，T4多聚核苷酸激酶可以显示出5'磷酸酯酶的活性，催化5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。当ATP和ADP都适量存在时，T4多聚核苷酸激酶可以催化5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。
T4 PNK具有广泛的应用，例如用于寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记，作为Southern、Northern、 EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等。它还可以催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸基团，使其可以与DNA或RNA的3'末端连接，并去除3'端磷酸基团。
作为常用的分子生物学试剂，T4 PNK在市场上需求量巨大。然而，目前存在一些问题，如无可溶性标签时易形成包涵体，通过包涵体复性可得到少量的活性蛋白，但在保存过程中蛋白易聚集形成聚体，形成沉淀，稳定性较差。增加可溶性标签可以提高可溶性蛋白的比例，但纯化后的蛋白活性较低，去除标签的成本较高且得到的活性蛋白稳定性较差。
活性单位指在37℃条件下，30分钟内催化1nmol酸不溶性[32P]掺入所需要的酶量。
1. 1x T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液：70 mM Tris-HCl pH 7.6，10 mM MgCl2，5 mM DTT，37℃温育。
2. 进行热失活时，将反应体系加热至65℃并加热20分钟。
3. 在放射性标记实验中，可使用1x T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50pmol的γ-[32P] ATP和20单位的酶，在37℃温育30分钟。
4. T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性，在磷酸化修饰核酸时，请单独添加终浓度为0.5~1mM的ATP。
5. 要提高平齐末端或5’凹陷末端的磷酸化效率，可在加入T4多聚核苷酸激酶前，先将DNA溶液加热至70℃加热5分钟，然后冰上冷却，并加入5%（W/V）的PEG-8000。
6. 一般情况下，进行激酶反应后会进行连接反应。在这种情况下，T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37℃温育30分钟即可。如果连接时需要保持其他DNA片段的去磷酸化状态，则需要在连接反应前热失活T4多聚核苷酸激酶。
[1] CN201611141222.0 T4多聚核苷酸激酶重组酶及其制备方法、表达基因、表达载体以及宿主细胞
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