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WB的条带总是很淡,如何解决?

做western blot,结果总是不理想,目的条带总是很淡,上样量已经是60ug了,封闭用的是5%脱脂奶粉,我还应该怎么改进哦?下面是我的结果,采用的是ECL化学发光,凝胶成像系统拍照,下面一条是我的目的条带。 麻烦各位帮帮忙吧!



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条带弱的原因可能有以下几个方面:

①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量,也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整,如英格恩的Enlight-plus。

②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率,也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶,判断转膜效率。

③. 抗体效价不高,用量不足,孵育时间太短,或抗体反复使用保存不当而失活。可考虑更换效价更高的抗体,或提高抗体稀释度,延长抗体孵育时间;若怀疑抗体失活,可用斑点杂交实验确定抗体活性。

④. 曝光时间太短。可适当延长曝光时间。
转膜应充分,并提高第一抗体的使用量!
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