草酸酯和脲及硫代巴比土酸的混合物，在加热至120°的条件下，会形成红色水溶液和醇溶液，并产生特征性的草酰胺产物。因此，这些酯类和脲在低于脲分解温度的反应中，必然会生成草酰胺。其中最敏感的反应是形成草酰胺和某些氨基甲酸烷基酯的反应。
本试验是从酯类的醚溶液中进行的，是一种特效的试验方法，可以在存在其他二羧酸酯类的情况下检测草酸酯类，但草酸一酰肼和二酰肼不能存在。
操作步骤：取少量酯或其酒精或醚溶液一滴，与数毫克脲和数厘克硫代巴比土酸混合。将混合物加热至120°，出现红色产物即为正反应。
鉴定限度：
| 2.5微克 草酸环己酯 | 3.5微克 草酸二苯酯 |
| 5微克 草氨酸正丁酯 | 2.5微克 草酸二甲酯 |
另外，通过热氨解形成草酰胺的方法也可以检测草酸的酰肼类。将样品和脲一起加热至135～140°，即可发生变化。脲会形成缩二脲并释放氨，而氨会导致氨解生成草酰胺。通过草酰胺和硫代巴比土酸的反应形成红色化合物进行检测。需要注意的是，温度不能超过135～140°，否则脲衍生的氨会使红色产物缓慢分解。
值得注意的是，氨解作用和利用湿法蒸发氨水形成草酸铵的方法都不适用，所以和脲熔融的方法成为热氨解作用的替代方案。
操作步骤：取少量试液或其固体与数厘克脲和硫代巴比土酸混合。将试管放入预热至110°的浴中，将温度升至130～140°。如果出现红色，则为正反应。
鉴定限度：5微克 草酸二酰肼
需要注意的是，和脲加热形成草酰胺的反应也适用于其酯类和烷基化的草酰胺。
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