MIRNA提取试剂盒是一种专用于从各种动物组织、植物组织、细胞、血清、血浆等样本中分离纯化miRNA的试剂盒。除了miRNA,它还可以提取siRNA、snRNA等其他小于200nt的小分子RNA,同时也可用于总RNA的提取。
该试剂盒采用了酚/胍裂解技术和硅基质膜纯化技术相结合的方法。独特的裂解液可以有效抑制RNases,并通过有机抽提的方法除去细胞或组织样品中的大部分DNA和蛋白。对于一些敏感的下游实验,可以单独使用该试剂盒对miRNA进行富集。
该试剂盒适用范围广,制备的RNA纯度高,可直接用于敏感的下游应用,如Northern Blot分析,Real-Time PCR,Microarray Analysis等。
MicroRNA是一类在进化上高度保守、在生命有机体的发育过程中具有重要调控功能的非编码小分子RNA。它的大小约为18-22个碱基。miRNA通过与靶基因的3'非翻译区完全或不完全的碱基互补配对结合,发挥对靶基因mRNA的抑制或转录后调控使功能蛋白降解的作用。在动物的胚胎早期发育、动植物细胞增殖、分化和凋亡等一系列生物学过程中,MicroRNA都发挥着重要作用。
①组织:将组织在液氮中磨碎。每30-50 mg组织加1ml TRIzon Reagent,震荡混匀。样品体积不超过TRIzon Reagent体积的十分之一。
②单层培养细胞:吸去培养液,加入TRIzon Reagent,每10cm2加入1ml TRIzon Reagent(裂解液用量视培养瓶面积而定)。
③细胞悬液:离心得到细胞沉淀,弃上清。每5×106-1×107细胞加入1ml TRIzon Reagent(细胞不需洗涤)。
④血浆或血清:取200μl血浆或血清样本,加入5倍体积TRIzon Reagent,震荡混匀30秒。
通过对小鼠成肌细胞系C2C12过表达或抑制miR-21的实验,发现miR-21能显著促进成肌细胞的增殖。随后,通过生物信息学方法预测并鉴定出miR-21的一个靶标基因TGFBI,提示miR-21通过调控TGFB/AKT-mToR信号通路调控骨骼肌的发育。
在小鼠个体水平上检测miR-21的表达水平,并建立C2C12细胞体外分化模型,发现miR-21在C2C12分化过程中表达显著下降。
通过免疫荧光检测方法分析miR-21对C2C12细胞增殖的作用,结果表明过表达miR-21能显著促进细胞的增殖;而抑制miR-21后,细胞的生长明显减缓。通过TargetScan和miRanda软件预测miR-21的靶标,筛选出TGFBI基因。
通过双荧光素酶报告基因实验确定了TGFBI的3'UTR含有miR-21的结合点,并通过qRT-PCR和western blot验证了miR-21在蛋白质翻译水平抑制TGFBI的表达,而不影响mRNA水平表达。
[1]Dysregulation of the TGFBI gene is involved in the oncogenic activity of the nonsense mutation of hepatitis B virus surface gene sW182*[J].Shih Sheng Jiang,Shiu-Feng Huang,Min-Syuan Huang,Yng-Tay Chen,Hsiang-Ju Jhong,Il-Chi Chang,Ya-Ting Chen,Jer-Wei Chang,Wen-Ling Chen,Wei-Chen Lee,Miin-Fu Chen,Chau-Ting Yeh,Isao Matsuura.BBA-Molecular Basis of Disease.2014(7)
[2]Regulation of T lymphocyte activation by microRNA-21[J].Lu Wang,Liangqiang He,Rong Zhang,Xiufeng Liu,Yongzhe Ren,Zhipeng Liu,Xiangyu Zhang,Wei Cheng,Zi-Chun Hua.Molecular Immunology.2014(2)
[3]TGF-β-Induced(TGFBI)Protein in Melanoma:A Signature of High Metastatic Potential[J].Laura Lauden,Johan Siewiera,Wahid Boukouaci,Kiran Ramgolam,Samia Mourah,Celeste Lebbe,Dominique Charron,Fawzi Aoudjit,Nabila Jabrane-Ferrat,Reem Al-Daccak.Journal of Investigative Dermatology.2014(6)
[4]MicroRNA-21 is a novel promising target in cancer radiation therapy[J].Jia Liu,Hongcheng Zhu,Xi Yang,Yangyang Ge,Chi Zhang,Qin Qin,Jing Lu,Liangliang Zhan,Hongyan Cheng,Xinchen Sun.Tumor Biology.2014(5)
[5]白立景.猪骨骼肌发育中相关miRNA的鉴定及miR-21生物学功能研究[D].中国农业大学,2014.