曲霉基因敲除？

有做过曲霉基因敲除的吗？用原生质体转化，同源臂1.5kb，之前转化子长不出来，现在长出来传了4代，表型正确但是pcr验证基因还在没有敲除，最近转化又长不出来，大半年了一点进展都没有，紧急求助？有做过的小伙伴可以指点一下吗？万分感谢啦