大家小年好！给各位朋友拜个早年呀，本人年后要做qPCR实验，老师要求在假期写好实验方案，查阅了RT-qPCR相关资料，仍有一些问题不太清楚，希望大家帮忙解答一下。
首先我做这个实验是为了确定该基因在两种不同条件下的表达量，所以选择相对定量的方法，实验步骤分为提取RNA、反转录制备cDNA、以cDNA为模板定量PCR三块，我的问题是：1 参照基因怎么选择，好像有GAPDH和actin（我知道的是这两种），但是这两个基因存在于我的实验菌株Sphingomonas sp吗？如果存在的话我是否需要逐个确定参照基因的表达量是稳定的，选出最合适的内参基因
2 反转录制备的cDNA是单链吗？是否需要以cDNA为模板合成互补链？为什么
3 反转录之后获得的应该是cDNA 池吧，因为RNA有三种啊，在不知道模板序列的情况下怎么设计目标基因的引物？
4 参照基因的引物怎么设计
5 在测定实验样本的目标基因和参照基因的Ct值时，起始RNA的量是否应该一致，做对照样本的实验时，RNA的量是否应该与实验组调整成相同
