ROSETTA(DE3)感受态细胞-CB108的特点及应用？ ¹

ROSETTA(DE3)感受态细胞-CB108是经特殊工艺处理得到的大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞菌株。该菌株通过补充6种稀有密码子，提高外源基因在原核系统中的表达水平，尤其对真核基因的表达有显著效果。

该菌株的基因型为F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(CamR)。

其特点包括：

1. 含有pRARE质粒，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA)，提高外源基因在原核系统中的表达水平。
2. 菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区，同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于多种质粒的蛋白表达。具有氯霉素抗性。转化效率可达108cfu/μg DNA。

如何使用ROSETTA(DE3)感受态细胞-CB108

使用说明如下：

1. 取100μl感受态细胞置于冰浴中融化。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入适量的目的DNA，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。
3. 进行42℃热击45sec，然后快速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min，该过程不要摇动离心管。
4. 每个离心管中加入450μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45～60min使菌体复苏。
5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12~16h。

ROSETTA(DE3)感受态细胞-CB108的应用

用于人NGAL原核表达及多克隆抗体的制备

ROSETTA(DE3)感受态细胞-CB108可用于构建NGAL原核表达载体，并在原核细胞中诱导表达人NGAL的融合蛋白pET28a-NGAL。通过纯化融合蛋白作为抗原，免疫动物制备多克隆抗体，为进一步研究NGAL的生物学功能奠定基础。

研究方法包括：

1. 构建NGAL原核表达载体，从K562细胞株总RNA中克隆NGAL的cDNA片段，将扩增片段与载体pET28a连接，转化ROSETTA(DE3)感受态细胞，筛选阳性菌落，提取质粒并进行测序验证。
2. 诱导pET28a-NGAL融合蛋白在ROSETTA(DE3)中表达，收集上清液和沉淀，进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白表达率。

参考文献

[1] Michael Haase, Rinaldo Bellomo, Prasad Devarajan, Peter Schlattmann, Anja Haase-Fielitz. Accuracy of Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin(NGAL)in Diagnosis and Prognosis in Acute Kidney Injury: A Systematic Review and Meta-analysis. American Journal of Kidney Diseases. 2009(6).

[2] Nathan A Stephens, Richard JE Skipworth, Kenneth CH Fearon. Cachexia, survival and the acute phase response. Current Opinion in Supportive and Palliative Care. 2008(4).

[3] Claire Villalva, Nathalie Sorel, Marie-Laure Bonnet, Jo?lle Guilhot, Caroline Mayeur-Rousse, Fran?ois Guilhot, Jean-Claude Chomel, Ali G.Turhan. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin expression in chronic myeloid leukemia. Leukemia & Lymphoma. 2008(5).

[4] Maret Bauer, Jens C.Eickhoff, Michael N.Gould, Christoph Mundhenke, Nicolai Maass, Andreas Friedl. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)is a predictor of poor prognosis in human primary breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 2008(3).

[5] 熊火梅. 人NGAL原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 南昌大学, 2011.