背景[1-3]
HCC94细胞分离自人宫颈高分化鳞癌裸小鼠移植瘤HCC94V第2代瘤组织，贴壁培养，6日细胞开始生长，首次传代38日，BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下移植成瘤。
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
用于子宫颈鳞状细胞癌中p16异常表达的分子病理机制研究
以HPV16阳性的子宫颈鳞癌Caski及HPV阴性的高分化宫颈鳞癌HCC94细胞为研究对象,对子宫颈鳞癌p16表达升高的分子机制进行了初步研究。
首先设计HPV16 E6/E7特异性引物,RT-PCR扩增E6/E7基因,构建E6/E7基因过表达质粒pcDNA3.1-HPV16E67。采用脂质体法将HPV 16E6/E7基因过表达质粒及对照空质粒分别转染至HCC94细胞,实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别检测两组HCC94细胞中E6/E7及p16ink4a基因mRNA和蛋白表达水平。
设计合成E6/E7基因特异性shRNA干扰质粒,将干扰质粒及空质粒载体经脂质体介导分别转染至caski细胞中,实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别检测两组caski细胞中E6/E7基因沉默效率及p16ink4a基因mRNA和蛋白表达水平。
实验结果显示,在过表达E6/E7的HCC94细胞中,E6/E7及p16ink4a基因在mRNA和蛋白水平上表达量均有明显上升;在沉默E6/E7的caski细胞中,E6/E7及p16ink4a基因在m RNA和蛋白水平上表达量均有明显下降。
[1]Telomere length and telomerase activity are related with immortalization frequency but not with replicative senescence in mammalian embryonic fibroblasts,except human embryonic fibroblasts[J].Hyun-Seok Kim,Jae-Seung Hong.Animal Cells and Systems.2014(6)
[2]Sustained p16 INK4a expression is required to protect against IR-induced lymphoma in mice[J].Lina Palacio,Krishna Vimal,Oahn Le,Norman Sharpless,Christian Beausejour.Experimental Hematology.2014(8)
[3]Role of p16 gene promoter methylation in gastric carcinogenesis:a meta-analysis[J].He-Ling Wang,Ping-Yi Zhou,Peng Liu,Yu Zhang.Molecular Biology Reports.2014(7)
[4]Differential Mechanisms of CDKN2A(p16)Inactivation in Oral Tongue Squamous Cell Carcinomas and Correlation With Patient Outcome[J].A.M.Lim,H.Do,R.J.Young,S.Q.Wong,C.Angel,M.Collins,J.Corry,D.Rischin,A.Dobrovic,B.Solomon.International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics.2014(2)
[5]张昊.子宫颈鳞状细胞癌中p16异常表达的分子病理机制研究[D].河北北方学院,2017.
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