AAV-293/人胚肾细胞是一种来源于HEK-293细胞株的细胞系,但其产生的病毒滴度更高。AAV-293/人胚肾细胞与HEK-293细胞一样,可以反式表达腺病毒E1基因。通过共转染三个AAV助质粒,AAV-293/人胚肾细胞可以产生有感染力的腺病毒-相关病毒颗粒。因此,AAV-293/人胚肾细胞株被广泛应用于腺病毒相关重组病毒的繁殖。AAV-293/人胚肾细胞生长培养基的配方为MEM高糖+10%FBS+1%P/S,冻存条件为液氮。
AAV-293/人胚肾细胞可用于构建睫状神经营养因子(CNTF)基因和绿色荧光蛋白(GFP)共表达的腺相关病毒载体,以获得高效的腺相关病毒转基因平台。具体方法包括设计引物扩增CNTF蛋白编码区序列,并将其插入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP中,构建CNTF和GFP共表达的腺相关病毒载体(pAAV-CNTF-IRES-hrGFP)。通过脂质体介导转染和共转染AAV-293/人胚肾细胞,可以包装产生腺相关病毒(rAAV-CNTF),并用于感染人视网膜色素上皮细胞(RPE)。荧光显微镜观察结果显示成功表达了GFP。
实验结果表明:
1)通过PCR法和酶切分析鉴定,pAAV-CNTF-IRES-hrGFP质粒插入的DNA片段与预期结果一致,进一步测序结果证实插入片段为CNTF目的基因,且其DNA序列和读码框正确。
2)共转染AAV-293/人胚肾细胞后,荧光显微镜观察到大量绿色荧光,PCR验证了病毒携带CNTF基因。
3)带有CNTF的重组腺相关病毒成功感染了体外培养的人RPE细胞。
[1] 睫状神经营养因子和绿色荧光蛋白共表达的重组腺相关病毒载体的构建