普通DNA产物纯化试剂盒采用独特的离心吸附柱,能够高效、专一地与DNA片段结合,并去除蛋白质、离子和引物小片段等杂质。除了适用于PCR产物回收,它还可以用于酶反应液的回收,如酶切、连接和探针标记等。该试剂盒可回收100 bp-20 kb范围内的DNA片段,回收率可高达80%以上(对于<100 bp或>10 kb的DNA片段,回收率为30%-50%)。得到的DNA可以直接用于连接、转化、酶切、测序、杂交等分子生物学实验。
速度最快:只需15分钟即可完成DNA回收,同时可以处理多个样品,节省时间。
步骤最少:操作简单,只需几次离心即可完成。
效率最高:独特的离心柱和精心配制的缓冲液保证每次回收到的DNA量最大。
处理量:每个离心吸附柱每次最多可吸附10μg的DNA。
本研究探讨了含有重组质粒pcDNA3.1-IL-24工程菌的构建、发酵、大规模裂解条件,以及重组质粒pcDNA3.1-IL-24的分离纯化路线和质量检测体系的建立。
首先将已构建好的重组质粒pcDNA3.1-IL-24转化大肠杆菌E.coli DH5a,构建rh-IL-24工程菌。经过传代稳定性的考察后,在BIOFLO 40L发酵罐中进行发酵,通过补料分批发酵的方式,控制发酵温度在36℃-38℃之间,发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%-50%之间,PH保持在7.0左右。发酵结束后,收获的菌体约为36g湿菌体/L。
然后,离心收集菌体,使用碱裂解法大量制备粗制质粒DNA。首先通过盐沉淀法粗纯质粒DNA,然后使用离子交换层析、疏水层析和分子筛层析进一步纯化,最后进行无菌超滤,将质粒DNA浓缩到药用剂量后分装到安瓿中保存。
根据国家食品药品监督局颁布的《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》,建立了相应的质粒DNA质量检测体系,对质粒DNA产品进行质量鉴定。结果表明,本工艺制备的质粒DNA外观澄清,无杂质;pH值为7.2;质粒DNA浓度为727μg/mL;纯度(OD260/OD280)为1.87;杂质蛋白含量为0.007μg/μg质粒DNA;无RNA和抗生素残留;细菌内毒素小于0.007EU/μg质粒DNA。
与传统实验室方法相比,本工艺生产流程避免使用有毒试剂(如苯酚和氯仿)和动物源性酶类(如RNase A),确保了产品的安全性,同时也减少了检测有毒试剂残余量的繁琐步骤。本工艺使用的大多是价格低廉的国产试剂,所用的材料和设备(如凝胶和反应器)可以反复再生使用。
本工艺具有生产周期短、经济性好的特点,能够满足实际生产需求。此外,操作简单、易于放大、重复性好,并且建立了相应的质粒DNA质量检测体系,对于药用级质粒DNA的大规模制备具有重要的现实意义,也为同类研究的进行奠定了理论基础,为进一步的工业化生产提供了借鉴。
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