最近看帖看到做T7 RNA聚合酶体外转录的新手遇到一些问题，这些问题也是比较典型，
问题：
首先第一个问题就是杂带多，转录出来的产物外还有一团什么都不知道的鬼东西影响心情，和产物分得开不说，离的很近还影响切胶回收；
第二个问题产量低，目的产物产量低是好多新手介意的，转录了大半天，结果产物条带弱的要死，下步切胶纯化信心顿时凉了半截；
第三个问题产物不稳定，转录的也多，切胶手法也麻利，当时测得浓度也不错，可是放一段时间后浓度低了一大截。
建议：
我先声明，我不是什么高手，只是体外转录做的比较多。
第一个问题原因是多样的，杂带的出现首先你得想想你的模板DNA是否纯净，双链DNA在杂交配对前单链时就应该page纯化，纯化后才组装成双链模板；其次就是启动子设计是否合理，我们公司有位客户就是如此，启动子设计不合理，导致目的产物外还有一团连续的杂带在目的条带的上面（当然他用的是promega的体外转录试剂盒转录，产生了连续的杂带，我们公司提供的就只有单一产物带），最后想到的就是酶了，有些公司提供的T7 RNA聚合酶纯度不高，导致杂酶产生了其他的反应，这个没办法。
第二个问题产量低，这个原因还是很好分析的，首先是RNA操作的基本保障有没有--无菌无酶的枪头、离心管及使用的水，这些没问题前提下，再就是启动子的质量了，TATAGGG，后面三个G，第一个G必须的，第三个可不要，后两个G会影响转录效率，最后就是转录酶的活性了，其他都没问题，活性低的酶同样反应时间再怎么产量也上不去啊。
第三个问题在第二个里面已经提到了，就是RNA操作的基本保障--无菌无酶的枪头、离心管及使用的水，正常的RNA是比较容易被环境中的酶降解，而修饰后的RNA稳定性很好，耐RNase A酶降解，但是正常RNA可以用于转录翻译，而修饰的RNA不能，我在公司使用高活性突变型T7 RNA聚合酶转录的修饰RNA，产物非常单一，经过大浓度DNA酶及RNA酶的酶解，依然非常稳定。所以根据项目课题需要选择最合适RNA是很重要的。
