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加上内参做了三个的蛋白,但是最上面那个120kDa的蛋白显影非常模糊是怎么回事?

如图,加上内参做了三个的蛋白,自上而下分别是120kDa、82kDa,内参Actin 42kDa。但是最上面那个120kDa的蛋白显影非常模糊。

浓缩胶5%,分离胶12%

电压是浓缩胶中80v  30分钟待跑到分离胶更改为120v 约1小时

120kDa蛋白抗体按照说明书1:1000稀释的,只是1%脱脂奶粉配成了2%的。这个120kDa跟其他的不同,其他两个蛋白是按照转膜后常温封闭2小时,一抗孵育过夜。这个120kDa的蛋白我跟其他的一起做了,但是说明书上写的推荐protocol是过夜封闭,一抗常温2小时,会不会是这个孵育的影响呢?


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共2个回答
首先,你把膜剪得太窄了,82kD和42kD的条带都压边了,这样做出来的结果不可用。43和82好剪开。120和82跑一张,你就别剪开回收重新孵育,要么你就分开做两张胶跑。至于“常温封闭2小时,一抗孵育过夜”,这个没问题。建议10%分离胶;增加上样量,(和/或) 降低内参浓度,增加120和82的浓度。脱脂奶粉或BSA,封闭和稀释一抗我都是用5%,没用过1%,稀释二抗随意很多。
如果确定蛋白本身不是弥散的,120kDa的蛋白可以试试从头到尾一个电压,即中间不换电压,80V跑到底
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