我用的试剂盒是aviva system的，TMB底物加入之后感觉反应太过剧烈，加入之后高浓度的孔立即就开始变蓝，说明书是37度15-30分钟，孵育恰当的标准是：高浓度四孔变蓝色，低浓度（包含空白孔）无明显蓝色。我实际操作过程中，37度孵育15分钟已经全部孔变蓝，最终测下来od值过高，标曲八个点，空白0.2+，高浓度两空3以上，结果就是前六个点还是线性挺好的（r=0.9991），高浓度两个点完全不行。另一个问题是：我摸索了待测血清的稀释浓度，分别是不稀释、1/10、1/50、1/100，结果不稀释和1/10两个浓度测出来是负值（od小于空白对照），1/50和1/100测出来的值在标曲范围内（只取了线性好的前六个点），但是测值和稀释倍数也不成比例。
请教各位：
1、听人说TMB底物常温避光反应也可以，我能不能常温呢？这样我就好控制反应时间，还是继续37度孵育，把孵育时间缩短到10分钟甚至5分钟
2、高浓度血清标本（不稀释、1/10稀释）测出负值应该怎么解释，厂家技术支持说可能浓度太大影响抗原抗体结合，这个能说得通吗？
3.空白孔是不是应该不变色才对？空白孔显色是不是洗板时孔间污染导致的？要是这样的话，为什么前六点（含空白）标曲是好的？
谢谢大家了
