本文将介绍2’-脱氧鸟苷的合成方法，这对于理解该化合物的制备过程以及在药物合成和化学领域的应用具有重要意义。
背景：近年来，人们对核苷及其衍生物在抗病毒和抗肿瘤方面的作用越来越感兴趣。1992年，C. Perigaud等人对核苷类抗病毒药物进行了综述。2′-脱氧鸟苷作为合成寡脱氧核苷酸等多种抗病毒、抗肿瘤核酸药物的重要原料，在市场上需求广泛。然而，脱氧鸟苷的化学合成一直存在困难，迄今为止仍未有成熟的方法被报道。目前，获得脱氧鸟苷的主要方法是采用DNA作为原料，首先经核酸酶水解生成脱氧核苷酸，然后再通过磷酸单酯酶水解形成脱氧核苷。这种方法成本高，而且DNA来源有限，限制了其大规模生产的可能性。
关于酶法合成脱氧鸟苷的报道,日本横关键三等应用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)生成脱氧鸟苷的方法,但转化率仅为2 8%。Yokozeki等使用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)为酶源,以2′-脱氧尿苷和鸟苷为底物,2′-脱氧鸟苷转化率仅为18%。其它亦有用胸苷和2,6-二氨基嘌呤生成2,6-二氨基2′-脱氧核苷,再用腺苷脱氨酶处理得到脱氧鸟苷的方法,但工艺步骤多,成本较高。
合成：
1. 方法一：
以脱氧胸腺嘧啶核苷(Thymidine, dTR)为脱氧核糖的供体,鸟苷酸(Guanosine monophosphate, GMP)为碱基鸟嘌呤的供体,在核苷磷酸化酶的作用下合成脱氧鸟苷。具体步骤如下：
（1）乙酰短杆菌的培养和湿菌体制备
在1L的带挡板的锥形瓶中装入发酵培养基200mL,于121℃灭菌20min,冷却后从新鲜、长势良好的乙酰短杆菌斜面上接种,36℃培养16 h,然后将培养液10000r/min离心10min,弃去上清液,所得菌体用30mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤2～3次,作为酶源冷冻备用。
（2）脱氧鸟苷酶法合成及工艺优化
20mmol/L的脱氧胸腺嘧啶核苷(dTR),20mmol/L的鸟苷酸(GMP),5%的湿菌体,100mL 30mmol/L pH6.98磷酸盐缓冲液作为标准反应混合物,在60℃的恒温水浴槽中搅拌反应,反应时间为6h。在不改变其它条件的情况下,依次考察不同的反应温度、菌体量、反应pH、磷酸盐缓冲液浓度、底物浓度、底物比率和反应时间对酶反应的影响,优化其反应条件。
（3）酶反应液中脱氧鸟苷的分离纯化
取适量的脱氧鸟苷反应液,高温灭活后用硅藻土过滤,在其中加入5mmol/L的四硼酸钠,再通过pH中性的氯型阴离子树脂进行分离,以0.5倍柱体积每小时的流速上样洗脱,上样结束后用0～0.2mol/L的NaCl进行梯度洗脱,分布收集洗脱液。取收集到的脱氧鸟苷洗脱液脱盐浓缩结晶,得到脱氧鸟苷样品。
2. 方法二：
以β-胸苷和鸟嘌呤为原料，采用发酵乳杆菌菌体浆状物为生物催化剂，在聚乙二醇10000/磷酸氢二钾双水相系统下进行生物催化反应，得到2’-脱氧鸟苷产物。在最优化条件下，底物β-胸苷加入量达到16.5g/L，胸苷转化率达89％，产物2’-脱氧鸟苷达16.1g/L。
3. 方法三：
(1)培养乙酰短杆菌(Brevibacterium-acetylicum)QD96-CGMCCNo.0472；(2)然后将步骤(1)获得的菌体加入底物溶液，其底物溶液中，含有脱氧核糖受体、脱氧核糖供体和磷酸缓冲液，反应，然后从反应产物中收集2’-脱氧鸟苷。该方法使用乙酰短杆菌QD96的酶合成2’-脱氧鸟苷，可低成本，高收率地获得2’-脱氧鸟苷，其转化率可达60％以上。
参考文献：
[1]李喻,窦洁,曹静,等. 乙酰短杆菌酶法合成2'-脱氧鸟苷[J]. 药物生物技术,2011,18(2):119-123.
[2]乐山市瑞和祥生物制药有限公司. 一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法:CN201510140553.1[P]. 2015-08-12.
[3]南通秋之友生物科技有限公司,江苏秋之友核酸药物工程技术研究中心有限公司. 用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶合成2’-脱氧鸟苷的方法:CN201010611733.0[P]. 2011-09-07.
[4]韩国威. 单线态氧损伤2'-脱氧鸟苷和8-氧代脱氧鸟苷机理的理论研究[D]. 郑州大学, 2012.
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