钙在水溶液中以2价阳离子形式存在，其氢氧化物为强碱。许多含有羟基的有机试剂能与钙生成稳定的化合物，其中一种常用的显色剂是乙二醛－双[2－（羟基缩苯胺）]（GBHA），这是一种具有很高灵敏度和选择性的方法。此外，钙色素也是钙的高选择性试剂。
钙色素在pH2时与钙离子形成红色螯合物，在510毫微米处呈一最大吸收，此时的摩尔吸收系数为7．6×10^3，且可在Sr^2+和Ba^2+占优势的样品中测定较少量的钙。
GBHA法
乙二醛－双[2－（羟基缩苯胺）]与Ca^2+在碱性溶液中生成难溶络合物，反应为：
在1：1的水－甲醇溶液中上述络合物逐渐溶解，这是因为与钙离子相配位的两分子水被甲醇分子替代的结果。试剂在甲醇溶液中呈无色，倘加入氢氧化钠溶液则呈黄色，这可能是由于与羟基的离解作用的缘故。在实际工作中通常加入2毫升1N NaOH溶液（按最终体积为50毫升计算）而使溶液获得最适宜碱度，对NaOH而言约为0.04N，即此时试剂与钙离子的反应可进行完全，而此时试剂的颜色亦并不显著，它们的吸收曲线如图(Ⅷ-14)。
这种红紫色络合物的最大吸收在516毫微米处，其摩尔吸收系数为1.8×10^4。溶液经10分钟后方发色完全，以后便开始逐渐退色，半小时后约退去2－3％。除钙外由于试剂亦能与许多两价离子（如锶、钡）作用，此时可加入氰化物和硫化钠作为掩蔽剂，再加入小量的硫酸盐或碳酸盐防止锶和钡离子的干扰。镁及碱金属离子不干扰钙的测定，但碳酸盐、氟化物、草酸盐、酒石酸盐及EDTA等不允许存在。
试剂和溶液：
1．乙二醛－双[2－（邻羟基缩苯胺）] 0.05％甲醇溶液，称取50毫克试剂溶解在100毫升溶剂中即可。溶液可保存一星期；
2．钙标准溶液 称取在110℃干燥恒重的CaCO3固体2.4980克溶解在除尽CO2的40毫升2N HCl中，移入1升容量瓶内，加水至刻度，此时浓度为每毫升含钙1毫克，制作标准曲线时根据需要稀释之；
3．苛性钠溶液 1N及5N溶液；
4．偶氮－氧化偶氮BN 0.01％溶液，称取该试剂10毫克溶解在100毫升四氯化碳中。使用前每10毫升该溶液中加1毫升磷酸三丁酯；
5．四氯化碳；
6．磷酸三丁酯。
测定步骤：为了分离除去干扰离子，先在试液中加5N NaOH溶液至试液碱度约为0.5－1N（对NaOH而言），再用加有磷酸三丁酯的偶氮－氧化偶氮BN的四氯化碳溶液萃取振摇1分钟，这时钙进入有机相而干扰离子大都留在水相中。将有机相与水相分开后，在有机相中加入一定量的0.1N盐酸再萃取钙。此时的偶氮－氧化偶氮BN溶液保存起来下次又可再使用。
取钙含量不超过50微克而无铵盐的分析试液一份（如有必要可加10毫克KCN和Na2S作掩蔽剂），用氢氧化钠或盐酸中和至pH7－8，加20毫克硫酸钠，25毫升乙二醛－双[2－（邻羟基缩苯胺）]溶液，2毫升1N氢氧化钠溶液，移入50毫升容量瓶中，加水至刻度，摇匀10分钟后在516毫微米（或用黄绿色滤光片）处测定消光度。用空白液为比较液。
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