请教WB高手，我现在做人β防御素2（hBD2）的WB检测，蛋白标本来自肺上皮细胞总蛋白提取液，我的分离胶用15%的胶，上样量为80ug/孔，电泳条件为70v（浓缩胶）、120v（分离胶），电泳后marker在胶上清晰可见，最小分子量的一条marker为10kd也可以清楚看到，我的目的蛋白hBD2分子量为7kd（abcam一抗，说明书上提示该产品分子量为7kd），故电泳后切胶时，在10kd以下切1cm宽的胶进行转膜；“三明治”夹的搭建应该没有问题；我的转膜条件为：湿转，300mA，50min，用的膜是0.22um PVDF膜（millipore）；5%脱脂牛奶室温封闭1.5h；abcam一抗1：750 4°C孵育过夜，HPR标记二抗（进口分装）1:2000，室温孵育2h；洗膜均为TBST（含0.1%吐温）10min×3次；最后ECL发光（pierce公司产品），内参选用GAPDH，内参条带非浓，很容易曝光，但是目的蛋白至今未能做出来（已经近1个月了），不知哪些步骤需要改进？期待回复，非常感谢！
另外说明一下，我提取的总蛋白，做其他指标（分子量为100kd，转膜条件为300mA，1.5h，用的膜为0.45um）是有条带的，可是是做hBD2没有任何条带让我看到！
