引言：
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场驱动蛋白质在凝胶中的迁移，根据其大小和电荷特性进行分离。它在生物学研究、医药领域及疾病诊断中具有广泛应用。
什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳？
聚丙烯酰胺凝胶电泳是由Raymond和Weintraub于1959年利用人工合成的凝胶作为支持介质创建的一种电泳方式，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。聚丙烯酰胺凝胶电泳在生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。聚丙烯酰胺凝胶具有可分离不同分子量的生物大分子、灵敏度高、化学惰性好、重复性好、透明度好等优点，目前尚无更好地支持介质能够取代它，但其不足之处在于操作过程繁琐。
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳如何进行？
聚丙烯酰胺是丙烯酰胺和交联剂 (甲叉双丙烯酰胺，BIS) ，在催化剂的作用下，聚合而成的高分子胶状聚合物。其凝胶透明，有弹性，机械强度高，可操作性强；化学稳定性好，对pH值、温度变化稳定，该凝胶属非离子型，没有吸附和电渗现象，并通过改变聚丙烯酰胺和交联剂的浓度可有效控制凝胶孔径的大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳主要依据分子筛效应和电荷效应对蛋白质进行分离。分子筛效应是指由于蛋白质分子的大小、形状不同在电场作用下，通过一定孔径的凝胶时，受到的阻力大小不同，小分子较易通过，大分子较难通过，随丙烯酰胺和交联剂浓度的增加，凝胶孔径变小，反之孔径变大，小孔径凝胶适合于小分子蛋白质或酶分离，大孔径凝胶适合于大分子蛋白质。丙烯酰胺凝胶电泳又可分为圆盘电泳和平板电泳。在品种纯度测定中主要应用平板电泳。
2. 聚丙烯酰胺凝胶的成分
聚丙烯酰胺水凝胶是由丙烯酰胺和 N,N' 亚甲基双（丙烯酰胺）（称为双丙烯酰胺）通过自由基聚合共聚而成，该聚合通常由自由基生成剂过硫酸铵引发，并由四甲基乙二胺 (TEMED) 催化。
3. 电泳中使用的凝胶类型
PAGE 可以在变性或非变性条件下运行，具体取决于分析的目的。
（1）SDS PAGE
在电泳分离之前，阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 与热量（有时还使用还原剂）一起用于使蛋白质变性，此过程称为SDS PAGE。热量会破坏维持二级和三级结构的氢键，而还原剂（例如 β-巯基乙醇）会切断二硫键。蛋白质与 SDS 线性化和复合，因此所有蛋白质均具有相似的质荷比。这消除了结构和电荷的影响，蛋白质仅根据其分子量的差异进行分离。该系统由Ulrich K. Laemmli开发，通常用于分离 5250 kDa 的蛋白质。
（2）天然 PAGE
在天然PAGE中，这些键保持完整，从而保留蛋白质的原始结构。因此，蛋白质在凝胶中的迁移主要受蛋白质的电荷性质（由其氨基酸序列和后翻译修饰决定）和分离pH值的影响，而不是其分子量大小。这种方法允许研究人员分析蛋白质的天然状态，特别适用于分析结合蛋白质或复合物时需要保持其生物活性的情况。为了保持蛋白质的天然状态，样品制备过程中避免使用SDS、还原剂和热处理，通常可以降低电压进行电泳分离。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的程序
（1）如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
对于 SDS PAGE，凝胶使用的缓冲液包括 SDS，但对于天然 PAGE，则省略了 SDS。
首先将分离胶倒入梳子下方的液面。添加聚合剂后，需迅速操作以防止凝胶开始固化。将凝胶移液到玻璃板之间时，要小心避免气泡的产生，然后在上方轻轻倒入一层水合异丙醇（IPA），确保边缘清晰。分离胶固化后，倒掉IPA并用水反复冲洗。现在将浓缩胶移液到顶部，放置梳子，确保没有气泡。凝固后的凝胶可立即使用或密封存放在冰箱中，加入少量水以防止脱水，直至需要使用。它们可以成功储存几天甚至几周，但存储时间越长，两层凝胶之间的扩散可能增加，最终可能影响到分离的结果。
（2）样品制备
将水煮沸，向缓冲液样品中加入2-巯基乙醇。
将含有蛋白质样品的缓冲溶液加入微量离心管中。
在单独的试管中取MW标记。
将样品煮沸几分钟，使蛋白质完全变性。
对于天然 PAGE，上样染料中不包含 SDS 和 β-巯基乙醇，并且不进行加热步骤来维持蛋白质的天然构象。
（3）电泳
取出凝胶盒并将其放入电极组件中。
用夹子支架固定电极组件。
为了填充凝胶孔，将 1x 电泳缓冲液倒入铸造框架的开口中。
使用移液管在孔中加入20-30ml变性样品。
盖上盖子盖住水箱。
连接设备并启动电源。
在紫外光下查看波段。
通常，对于 SDS PAGE，200 V 持续 35 分钟是一个不错的起点，而对于原生 PAGE，100 V 持续 40 分钟是一个不错的起点。
5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用和用途
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 是生物医学研究和临床环境中的一项常用技术。在生物医学和分子研究中，PAGE 可让科学家分离和分析蛋白质和核酸，从而深入了解细胞过程、基因表达和蛋白质功能。在临床上，PAGE 通过识别异常蛋白质模式或检测病毒等病原体的存在来诊断各种疾病。这种多功能性使 PAGE 成为在分子水平上了解健康和疾病的有力工具。
下图是通过 3D 打印聚丙烯酰胺来生成复杂的水凝胶结构。然后使用该方法创建具有微图案刚度的芯片实验室细胞培养表面，以测试刚度引导的集体细胞迁移。该技术有望带来广泛的应用，例如构建生物相容性弹性医疗设备和人造器官。
6. 电泳中琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶有什么区别？
琼脂糖孔径较大，适用于分离核酸和较大的蛋白质复合物。聚丙烯酰胺孔径较小，适用于分离大多数蛋白质和较小的核酸。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶通常用于电泳，但它们具有不同的特性，使其更适合分离不同的生物分子：
（1）材料和孔径
琼脂糖是从海藻中提取的天然多糖。它形成具有大孔的凝胶。聚丙烯酰胺由丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体聚合形成的合成聚合物。它的孔比琼脂糖小得多。
（2）解析能力
由于孔较大，琼脂糖凝胶的解析能力较低。这意味着它们可以分离较大的 DNA 片段（通常为 100 个碱基对到几兆碱基），但无法区分非常相似的分子。
聚丙烯酰胺凝胶的孔更紧密，解析能力更高。这样可以高精度地分离较小的分子，如蛋白质（从几 kDa 到几百 kDa），甚至小的 DNA 或 RNA 片段（少于 1000 个碱基对）。
（3）应用
琼脂糖主要用于分离较大的 DNA 片段，用于分析限制性消化、检查质粒 DNA 或可视化 PCR 产物等任务。
聚丙烯酰胺由于其能够根据大小分离蛋白质，因此是蛋白质电泳的首选。当需要高分辨率时，它还用于分离小的 DNA 或 RNA 片段。
参考：
[1]吴建忠,王玉苹,许源媛,等. 聚丙烯酰胺凝胶电泳操作注意事项研究 [J]. 安徽农业科学, 2014, 42 (33): 11636-11637+11643. DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.33.011.
[2]孙开玲. 浅析聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定技术 [J]. 种子世界, 2010, (06): 34-35.
[3]https://en.wikipedia.org/wiki/Polyacrylamide
[4]https://www.geeksforgeeks.org/
[5]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7482135/
[6]https://www.technologynetworks.com/analysis/articles/polyacrylamide-gel-electrophoresis-how-it-works-technique-variants-and-its-applications-359100
[7]https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-gel-electrophoresis.html
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