在本文中，我们将探讨制备(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法，通过这项研究，我们希望为(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的高效制备提供一个可行的解决方案。
背景：对映体纯的手性胺包括伯胺、仲胺和叔胺，在合成多种生物活性化合物(如农用化学品和药物)时扮演着重要的角色，已被广泛应用于制药行业、农业化工及材料等领域。
3-氨基哌啶(3APi)及其光学活性衍生物是一类非常重要的医药中间体，例如可用于合成治疗Ⅱ型糖尿病的药物阿格列汀和利拉利汀。目前主要通过化学方法合成3-氨基哌啶(Decosta B R，et al.，1992，Journal of Medicinal Chemistry)，但化学合成方法不仅操作复杂，产率和产物光学纯度较低，后期处理包括拆分剂的循环利用和对映体的回收等过程也耗费时间和精力，因此通过生物催化转化法制备3-氨基哌啶具有良好的研究价值。
合成：
1. 专利CN 111647634 A提供一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法，所述方法包括：将一定量的固定化转氨酶填充于填充床中构成反应器，所述反应器水浴保温，自所述反应器的一端将反应液以一定流速泵入所述反应器中，在所述反应器的另一端收集流出物，实现(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的合成；其中，所述固定化转氨酶通过将ω-转氨酶固定在氨基-环氧树脂上制得，所述反应液包含：N-Boc-3-哌啶酮、异丙胺以及磷酸吡哆醛。根据该发明，采用的连续流催化模式能够原位去除产物，有效降低产物抑制的影响，提高催化效率，具有高时空产率、可持续等特点，反应条件温和，操作简便，延长固定化酶使用寿命，具有良好的应用前景。
其中填充床是长度为10～30cm，内径为10～20mm的玻璃层析柱，固定化转氨酶的用量为1～10g，反应液中N-Boc-3-哌啶酮的浓度为20～200mM，异丙胺为N-Boc-3-哌啶酮的1～5倍当量，磷酸吡哆醛的含量为0.1～1mM。反应器中的流动方向为自上而下，反应液在反应器中的平均停留时间为5～15min，反应器在20～60℃下水浴保温。
固定化转氨酶按以下方法制备：
S1：发酵培养含有重组质粒ATA-W12-pET-28a的大肠杆菌，收集湿菌体，重悬于100mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，离心得到ω-转氨酶粗酶液；
S2：称取一定量的氨基-环氧树脂，加入适量ω-转氨酶粗酶液以及缓冲液，摇床中处理一定时间，实现ω-转氨酶在氨基-环氧树脂上的固定化；
S3：过滤抽干并用磷酸盐缓冲液洗涤除去未能固定的蛋白，加入含3M甘氨酸的50mM磷酸盐缓冲液在摇床中处理一定时间，用于封闭未反应的环氧基位点； S4：抽滤洗涤，制得所述固定化转氨酶，向其中加入100mM磷酸盐缓冲液，4℃冰箱保存，即得。
2. 王继国等人从土壤宏基因组中筛选出了一种来源于柄杆菌属的新型ω-转氨酶ATA-W12，以异丙胺为供体在1 mL反应体系中转化了85.84% 1-Boc-3-吡咯烷酮 (20 mmol/L) 和67.42% 1-Boc-3-哌啶酮 (20 mmol/L)。酶学筛选发现，ATA-W12 在40 ℃孵育168 h活力维持不变；优选反应条件为pH 8.5、40 ℃；这些特征利于工业用理想氨基供体异丙胺的使用。王继国等人已采用ATA-W12实现了100 g/L光学纯(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶的50 mL实验室规模制备，为进一 步工业化生产打下基础。
1-Boc-3-氨基哌啶的50 mL放大规模制备：采用50 mL放大规模制备(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶，反应体系包括5 g ATA-W12湿菌体、500 mmol/L 1-Boc-3-哌啶酮、1.5 mol/L酸化IPA、 2 mL二甲基亚砜、0.2 mmol/L PLP和100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)。反应在100 mL反应瓶中进行，利用2 mol/L IPA水溶液流加控制pH值为8.5，温度控制在 40 ℃，搅拌速度为300 r/min。每小时取3个重复样检测反应进程，通过HPLC分析检测。转化率 测定采用ZORBAX Extend C18 (4.6 mm×250 mm×5 μm)，流动相为28%乙腈︰72% TFA溶 液 (0.1%)，流速为0.8 mL/min，柱温37 ℃，进样量5 μL，210 nm紫外检测。转化率通过产物摩尔量除以添加底物摩尔量的比率来计算。取反应后溶液100 μL加入500 μL的乙酸乙酯萃取2次，加入无水硫酸钠干燥过夜，溶于异丙醇后用HPLC测ee值。ee值测定采用Chiralcel AD-H，流动相为90%的正己烷︰10%的乙醇，流速为1 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL，210 nm紫外检测。反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取相，12000 r/min离心10 min后取有机相，旋转蒸发得到(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶。
参考文献：
[1]汪湘湘. 固定化ω-转氨酶及其连续流催化合成（S）-1-Boc-3-氨基哌啶的研究[D].华东理工大学,2020.DOI:10.27148/d.cnki.ghagu.2020.000064.
[2]王继国,谢有余,王华磊等.一种新型ω-转氨酶的工业适应性选择[J].生物工程学报,2020,36(09):1929-1938+1-10.DOI:10.13345/j.cjb.200033.
[3]华东理工大学. 一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法:CN202010659240.8[P]. 2020-09-11.
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