如何制备PIEC猪动脉内皮细胞? ¹

PIEC猪动脉内皮细胞是通过胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备的。经过内皮细胞专用培养基培养筛选，可以得到纯度超过90%的细胞。这些细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等有害物质。

PIEC猪动脉内皮细胞是从猪的主动脉组织中分离得到的。主动脉是体循环的动脉主干，它的路径包括升主动脉、主动脉弓、降主动脉和腹主动脉等。主动脉内皮细胞是覆盖在主动脉内面的单层细胞，可以分泌一系列血管活性物质来维持血管的稳态。当主动脉内皮细胞受到炎症或其他刺激时，血管的稳态会被破坏，从而导致一些心血管疾病的发生。

因此，研究主动脉内皮细胞对于了解心血管疾病的发病机制和治疗药物至关重要。内皮细胞是一种特殊的上皮细胞，由一层扁平细胞组成，形成血管的内壁。它分布在整个循环系统中，从心脏到最小的微血管。

PIEC猪动脉内皮细胞的应用

用于人α1，2岩藻糖苷转移酶（HT）基因转移及其抗异种移植免疫排斥的研究

研究人α1,2岩藻糖苷转移酶（HT）基因转移和抗异种移植免疫排斥的方法，可以通过分子生物学和基因工程技术构建含有HT基因的重组质粒，并在猪细胞中表达该基因。这样可以合成H抗原，并同时降低异种抗原α-Gal的表达。

具体方法包括使用HindⅢ/XbaⅠ双酶切pRc/CMV-HTcDNA和pcDNA3质粒，将HTcDNA连接到pcDNA3质粒上，构建pcDNA3-HTcDNA重组质粒，并进行PCR、多酶切和测序鉴定。

此外，还可以建立猪主动脉内皮细胞原代培养、猪髂动脉内皮细胞（PIEC）系和猪肾PK-15细胞系的传代培养方法。

通过脂质体转染法将pcDNA3-HTcDNA转染到上述猪细胞中，然后使用新霉素（G418）筛选出具有抗性的细胞克隆。通过PCR检测重组HT基因的整合，RT-PCR检测重组HT基因mRNA的表达，流式细胞术（FCM）检测转染细胞中H抗原和异种抗原α-Gal的表达。

对照组可以使用未转染的正常猪细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。

研究结果表明，重组质粒成功转染到三种猪细胞中，并得到抗性细胞克隆。PCR扩增出人HT基因片段，RT-PCR证实人HT基因mRNA在猪细胞中表达，FCM检测显示转染细胞中H抗原表达升高，而异种抗原α-Gal的表达明显降低。

综上所述，转移重组人HT基因可以在猪细胞中表达，合成H抗原，并同时降低异种抗原α-Gal的表达。选择巨细胞病毒（CMV）启动子可以使人HT基因在各种猪细胞中广泛表达。

参考文献

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