求助同源重组敲除基因？

实验中已经将目的基因上下游和质粒构建一起转入大肠杆菌，在接合实验后经过10%蔗糖板筛选和单抗板筛选后共出来30来个符合条件的菌 但做pcr鉴定全是未敲除的 请问我是不是符合条件的菌太少了 做了两个月了还是没出来 着急啊