最近忙于质粒构建,意图将一段长约4000 bp的片段,通过BamH1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下:
1. 通过LA Taq酶扩增,并纯化回收目的片段(引物中带有酶切位点,保护性碱基=3,上游带有Kozak序列);由于回收效率很高,所以在进行下一步双酶切时只加了12 μl的目的片段,H2O 20 μl,10 X K BUFFER 4 μl,两种酶各2 μl,37℃作用过夜(12-14 h),再进行胶回收。
2. 载体pcDNA3.1提取质粒后,也按照以上的体系进行双酶切,时间为6 h。
3. 将酶切后的木点片段和载体均取2 μl进行电泳,结果显示大小与预期相符,亮度相近。
4. 连接时,目的片段:载体=4--10:1(因亮度相近,所以按照体积比)都做过,10 μl体系和15 μl体系都尝试过。5. 感受态为新制备的JM109,转化效率没有具体测过但别人用后均连接成功,阳性质粒眼观转化效率很高。
6. 限制性内切酶为TAKARA,T4连接酶是国内一家小公司的产品,不过实验室一直用,效果一直有保证,同期进行连接的其他同学也都连接成功。结果:转化后,平板上均有数量不等的菌落产生,少时4-5个,多时10来个。摇菌扩增8 h,进行菌液PCR检测(含阳性对照),检测组无阳性结果,但一直在1000 bp左右出现较弱条带,阳性组正常。提取质粒后,10 μl体系双酶切2 h,竟然在2000 bp和3000 bp处出现较弱条带(比Marker稍暗)。请指点迷津。如果有效果好的、适于长片段连接的方法,也请大家指教,多谢。