为什么TMB底物显色试剂盒在ELISA实验中被广泛应用? ¹

ELISA实验中，TMB底物显色试剂盒（ELISA，HRP显色）用于化学发光步骤。3,3',5,5'-四甲基（TMB）是一种优越的酶免试验显色剂，能够溶解于多种有机溶剂和双蒸水中，形成稳定的无色溶液。与过氧化物酶作用后，产生清晰的蓝色产物，非常容易观察。TMB底物显色试剂盒具有高灵敏度、稳定性好、无致癌特性等特点，因此被广泛用于酶联免疫（ELISA）试验和尿试纸的检测反应等。

TMB底物显色试剂盒主要应用于酶联免疫吸附实验（ELISA）。经典的方法是将试剂A、B分开配制，使用前再混合，并且长期存放稳定。该试剂一般为无色，有时略显浅蓝色或浅黄色。TMB显色液具有灵敏度高、稳定性好、显色终止后读数稳定等特点。在650nm检测时，底物溶液的背景小于0.04。

操作步骤：

1. 用适当的干净容器（用纯净水反复冲洗），取试剂A、B、C，按照A：B：C=5000:5000:4的比例混合，待达到室温后即可使用。
2. 加液：加完HRP结合物并温育一定时间后，洗板3～5次，每孔加入100ul的TMB显色液。根据实验需要，在室温（15～25℃）或37℃下温育10～30分钟。
3. 终止：加入等体积的1M盐酸或硫酸溶液终止反应，使孔中的反应液由蓝色变为黄色。
4. 读数：在终止反应后30分钟内，在450nm处进行读数。

注意事项：

如果出现高的反应背景或沉淀，表明TMB底物反应过于强烈。为了避免产生沉淀，可在终止后马上读数，或者进一步稀释一抗和/或HRP结合物，再次进行试验。

为什么TMB底物显色试剂盒被广泛应用于肿瘤标志物的可视化检测？

肿瘤标志物（Tumor Marker）是出现在血液和组织中与肿瘤有关的分子，对肿瘤患者的诊断具有重要意义。因此，开发一种早期灵敏检测肿瘤标志物的方法对临床研究和治疗至关重要。近年来，基于纳米材料类过氧化物酶活性的比色生物传感受到越来越多的关注，因为其成本低、易于制备和实用等优点。比色生物传感的关键是将检测事件转化为颜色的变化，并且可以通过肉眼进行识别。与生物酶相比，人工模拟酶具有稳定的催化活性、耐酸碱和温度能力强、对蛋白质变性不敏感以及生产成本低等优点。

在人工模拟酶中，特别是无机纳米材料模拟生物酶由于其独特的大小、形状、低毒性和高生物相容性等优点而被广泛应用于比色生物传感。本论文主要以制备的具有类过氧化物酶活性的纳米粒子Pd-Cu纳米粒子和NH2-GS@Pt-Pd-Ru纳米复合物为类过氧化物酶敏感材料，采用比色技术，分别建立了检测癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）的比色生物传感新方法。在过氧化氢存在的条件下，具有类过氧化物酶活性的Pd-Cu纳米粒子和NH2-GS@Pt-Pd-Ru纳米复合物可以催化辣根过氧化物酶的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）产生颜色反应。与辣根过氧化物酶类似，Pd-Cu纳米粒子和NH2-GS@Pt-Pd-Ru纳米复合物的催化活性依赖于pH、温度和过氧化氢浓度。

参考文献

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