血液增菌培养基是一种用于增菌实验的培养基,适用于血液、胸水、腹水等无菌液体标本中需氧菌的培养。它能满足各种需氧菌的培养需求。
该培养基的原理是在无菌情况下呈红色,有菌生长时变为黄色,产生碱性的细菌会呈现深红色。
血液增菌培养基的成分包括蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、葡萄糖、枸橼酸钠、对氨基苯甲酸、硫酸镁、酚红等。pH值为7.4±0.1,25℃。
使用时,将26.5克血液增菌培养基加热溶解于1000毫升蒸馏水中,分装到每瓶50-100毫升,进行121℃高压灭菌15分钟。
1、集标本和接种
在接种前,要仔细检查培养瓶内是否被污染,确保培养基的颜色从红色变为黄色。黑色血红蛋白颗粒是正常现象。
打开瓶上的铝盖进行严格消毒,无菌采集标本5-10毫升,直接用针头穿入橡胶塞中心部位入瓶内,加入标本(不可将注射器中的空气注入瓶内),取出针头后再次消毒瓶塞。
轻摇培养瓶使液体充分混匀,然后在瓶上标明病人的姓名、接种日期等信息。
2、培养
将培养瓶放入35-37度的培养箱中进行培养。
每天取出观察,看瓶中液体是否发生变色。
3、结果判读
如果在一周内发现培养基发生变色,血液层上有絮状沉淀,血液层表面或深层有白色颗粒,液体培养基凝固等细菌生长迹象,应立即进行菌种的分离鉴定和初步药敏分析。
目前,食品中致病菌的检测方法主要采用微生物常规培养法,需要37天,操作繁琐,试剂复杂多样,费用高昂,不能满足商品流通的实际需求。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速的特点,因此在食品中检测致病菌的研究方兴未艾。大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌是污染动物性食品的四种重要致病菌。
结合通用前增菌技术的研究,我们建立了一种多重PCR检测新方法,可以在LB培养基通用增菌后的6小时内一步同时检测食品中污染的这四种致病菌。该方法具有良好的特异性,简便快速,经济实用。实验结果如下: (1)对大肠埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、伤寒沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、单增李氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、荧光假单胞菌等九种食源性致病菌进行通用前增菌方法的研究,实验表明,在LB肉汤培养基36℃培养18小时,增菌效果最好,且增菌数量达到10^8 cfu/mL。
(2)在LB、NB和UPB培养基中,以30℃、33℃、36℃培养12小时,大肠埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、伤寒沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、单增李氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、荧光假单胞菌等九种菌的增菌数量达到10^6以上,也能满足PCR等检测方法的需求。但这几种培养基在36℃的培养时间应控制在12-18小时之间,不宜超过18小时。
(3)根据大肠埃希氏菌O157:H7的eaeA基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因、荧光假单胞菌的htpX基因,设计了4对引物。实验证实具有良好的特异性。
(4)我们建立了大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌的单重和多重PCR检测方法,并确定了多重PCR体系和热循环参数。经实验证实,所建立的方法具有很强的特异性。