植物Β-1,3-葡聚糖酶(Β-1,3 GLUCANASE)ELISA试剂盒是一种用于检测植物样本中Β-1,3-葡聚糖酶(Β-1,3 GLUCANASE)含量的双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒。
该试剂盒的实验原理是将预先包被β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）抗体的微孔板中，依次加入标本、标准品和HRP标记的检测抗体。经过温育和洗涤后，使用底物TMB进行显色。根据颜色的深浅和样品中的Β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）含量的正相关关系，使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），从而计算样品的活性。
操作步骤：
1. 从室温平衡20分钟后的铝箔袋中取出所需的微孔板，剩余的微孔板密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔中加入不同浓度的标准品，每孔50μL。
3. 样本孔中先加入待测样本，每孔10μL，然后加入样本稀释液，每孔40μL。空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体，每孔100μL。使用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟。
5. 弃去液体，使用吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，再次使用吸水纸拍干。重复此步骤洗板5次（也可使用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A和B，每孔50μL，37℃避光孵育15分钟。
7. 每孔加入终止液，每孔50μL，在15分钟内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断：
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作为横坐标，对应OD值作为纵坐标，绘制出标准品的线性回归曲线。根据曲线方程计算各样本的浓度值。
本研究从茶树中克隆出了β-1，3-葡聚糖酶基因cDNA1369bp的连续序列。根据茶树叶片的生化特点，对克氏-步法分离总RNA的方法进行了部分修改，从茶树鲜叶中分离并提取总RNA。
根据已发表的其他植物中β-1,3-葡聚糖酶基因的保守序列，设计了一对简并引物，并采用RT-PCR技术从茶树中扩增出了366bp的cDNA片段（RTPCR.1）。
将该片段克隆到PGEM-T Easy Vector上进行序列测定和分析，结果表明，该片段的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与已报道的其他植物β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA相应序列具有很高的一致性，因此认为该PCR特异产物为茶树β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA片段。
根据此片段序列设计特异引物，利用3’RACE获得了β-1,3-葡聚糖酶cDNA 3’端1252bp的cDNA片段（3RACE.1）。序列分析表明：RTPCR.1的3’端249bp与3RACE.1的5’端为重复序列。3RACE.1的核苷酸序列及其推测的氨基酸序列与拟南芥的β-1,3-葡聚糖酶基因家族的cDNA相应序列具有50％-90％的同源性。因此，本研究从茶树中成功克隆出了含有3’端β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA1369bp的连续序列。
[1]A novel flower-specific Arabidopsis gene related to both pathogen-induced and developmentally regulated plantβ-1,3-glucanase genes[J].Gabriele Delp,E.Tapio Palva.Plant Molecular Biology.1999(3)
[2]Molecular cloning,structure and expression of an elicitor-inducible chitinase gene from pine trees[J].Haiguo Wu,Craig S.Echt,Michael P.Popp,John M.Davis*.Plant Molecular Biology.1997(6)
[3]Diversity and genetic differentiation among populations of Indian and Kenyan tea（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）revealed by AFLP markers[J].S.Paul,F.N.Wachira,W.Powell,R.Waugh.TAG Theoretical and Applied Genetics.1997(2)
[4]β-1,3-Glucanase is highly-expressed in laticifers of Hevea brasiliensis[J].Mee-Len Chye,Ka-Yun Cheung.Plant Molecular Biology.1995(2)
[5]王朝霞.茶树β-1，3-葡聚糖酶基因cDNA片段的克隆与序列分析[D].安徽农业大学,2001.
1
