D-叔亮氨酸是一种重要的非天然氨基酸，可用作多种药物的中间体。由于其侧链含有叔丁基，具有较大的空间位阻，与其他分子耦联后有助于维持空间构象，并形成的酰胺键不易被体内酶降解。氨基酸是指含有氨基和羧酸的有机化合物，自然界中已发现300多种氨基酸。根据是否构成天然蛋白质的基本组成部分，氨基酸可分为天然氨基酸和非天然氨基酸，非天然氨基酸是指人工合成的各种氨基酸。除甘氨酸外，氨基酸都含有不对称碳原子，呈旋光性，根据空间排列位置的不同，可分为D-氨基酸和L-氨基酸两种，不同旋光氨基酸在生物体内发挥不同的生理作用。
通过改造源自Symbiobacterium thermophihum的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)变体生物催化剂，可以还原氨化合成ee值＞99％的D-叔亮氨酸。
突变酶蛋白的获取步骤如下：
1. 使用pET32-Dapdh质粒作为模板，通过QuickChangeMutagenesisKit突变试剂盒引入W121L、F146L、H227F三个位点的组合突变，并对突变质粒进行测序验证；
2. 将突变质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建工程菌；
3. 对构建的工程菌进行培养和诱导表达，突变体蛋白以可溶性形式存在于胞内；
4. 经Ni-NTA亲和层析纯化突变体蛋白，得到单条带的SDS-PAGE结果；
5. 对纯化后的突变子蛋白进行脱盐浓缩，用于建立催化反应体系。
D-叔亮氨酸的合成方法如下：
在葡萄糖/葡萄糖脱氢酶辅酶NADPH循环再生体系存在下，反应体系中的底物3，3-二甲基-2-羰基丁酸和氯化铵，在加入生物催化剂StDAPDH突变体后，于30℃反应24小时，每毫升反应体系中生物催化剂的用量约为0.5U。
反应产物构型检测方法如下：
向反应产物中加入高氯酸/加热变性蛋白质后，离心取上清，对上清中的产物进行FDAA衍生，利用L、D-叔亮氨酸标样做对照，经高效液相色谱进行分析，根据产物的保留时间确定产物构型和ee值。
通过StDAPDH突变子的还原胺化作用，3，3-二甲基-2-羰基丁酸和氯化铵的催化反应可以获得大于99％的对映选择性(ee)的D-叔亮氨酸。
[1]CN201310459718.2D-叔亮氨酸的一种生物催化制备方法
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