提问
盖德化工网  >  盖德问答  >  磷酸化蛋白,请问裂解...

磷酸化蛋白,请问裂解液中除了PMSF外,还要加一些什么蛋白酶抑制剂呢?

磷酸化蛋白,请问裂解液中除了PMSF外,还要加一些什么蛋白酶抑制剂呢?这些抑制剂的终浓度应该是多少呢?提磷酸化蛋白应该注意些什么呢?

0评论 +关注
共3个回答
磷酸化的蛋白很容易降解的,因此我们要在裂解液配方应该再加入几种磷酸酶抑制剂1mmol/LNa3VO4,1mmol/LNaF,不加的话,你的磷酸化的蛋白就有相当部分被去磷酸化!还要注意以下几点:1. 收集细胞,裂解细胞时一定要保持低温,温度的影响很重要的。用PBS洗涤细胞时,PBS一定要4度预冷。2. 蛋白一定要妥善保存,最好是收集完成后马上变性并于负80度保存,以保证降解程度最小3:煮好的样品最好分装保存,磷酸基团反复冻溶容易降解!4:电泳buffer等也可以加Na3VO4,如果是组织的话,提取蛋白时采用液氮研磨的方法,研磨器具最好提前预冷,保持低温的状态!
1、将提出的蛋白用超声振荡器震荡或用细针反复抽打5-6次这样可以使核苷酸打开,将磷酸位点暴露,更可以容易结合。2、抗体用5%牛血清蛋白稀释,效果还不错,你也可以试试。
祝实验顺利!
磷酸化蛋白酶常用的蛋白酶抑制剂包括:PMSF(1mmol/l)、aprotinin(1ug/ml)、pepstatin A(1ug/ml)、leupeptin(1ug/ml)、orthovanadate, beta-glycerophosphate,imidazole,sodium fluoride,molybdate,tartrate dihydrate, and so on.其中最常用的当属前面3种。应该注意的问题:1 保证蛋白的新鲜:1>如果是组织的,组织离体后应当立即放到液氮中保存,长期保存的话最好也在液氮中(如果条件不允许则放置-80度)。2>提取蛋白时采用液氮研磨的方法。3>避免蛋白的反复冻融,尽可能分装保存。2 蛋白酶抑制剂:各家应用的蛋白酶抑制剂的量和裂解液的配方不一,但是大都是上述几种抑制剂的混合物。如果条件好的化可以购买蛋白酶抑制剂cocktail (Calbiochem有专门的蛋白酶抑制剂Cocktail (组织的用II+III;细胞的用I+II)
国内供应商(6家)
PAI相关回答
您可能感兴趣的问答
 
请填写举报原因
选择举报原因
 
增加悬赏
剩余能量值
能量值