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PCR能分别扩出DN...
生物医学工程
PCR能分别扩出DNA片段的左右两个片段,为何不能扩出全长?
一个DNA片段2844 bp, 我用引物正向引物1(最左端), 反向引物1能扩出5端的2000bp;
用正向引物2(从2001bp处开始),反向引物2(从2844bp开始)能扩出3端的844bp。
用正向引物1和反向引物2无法扩增出全长2844。
4条引物的退火温度都接近,模板都相同,反应体系和酶都是相同的。尝试了很多条件,无法无法得到2844bp的全长,根本什么扩增产物都没有。
请大家帮忙分析,支招,多谢!
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共6个回答
小胖仙,化工设备专员
2020-10-31回答
会不会是组合的这对引物之间差异太大,所以难以扩增?
4条引物的退火温度、长短都接近啊。 你说的差异是指什么?
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晴明煦光,销售
2020-10-31回答
在确定引物没有组合错的情况下,理论上来说应该可以扩出来,
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烟诡,化学工艺工程师
2020-10-31回答
2000bp碱基处,形成了发卡结构,酶读不过去。试试高GC buffer.或者换酶。
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认栽,销售
2020-10-31回答
反向1和正向2必须有overlapping才可以
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幻墨轻尘,设备工程师
2020-10-31回答
1.Tm计算方式很多,用其他Tm计算方法,比如Primer Express试试看,F1和R2是不是Tm相差太多。
2.看看延伸时间够不够
3.优化一下体系看看,换硫酸铵+KCl双盐组成的缓冲液,会比KCl单盐的适合长片段扩增...
延伸时间设定的是3分钟,理论可以延伸4500 个核苷酸
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老街后街,化学工艺工程师
2020-10-31回答
会不会是组合的这对引物之间差异太大,所以难以扩增?
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