在ELISA测定中，碱性磷酸酶的色原底物最常用的是对硝基苯磷酸盐（p-nitropheny phosate，pNPP）。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚（pNP），其在405 nm处有最大吸收。由于碱性条件下pNP的光吸收增强，并可使碱性磷酸酶失活，因而可使用NaOH作为终止剂。二乙醇胺缓冲液中不能有单乙醇胺，因为单乙醇胺对碱性磷酸酶有温度依赖的抑制作用。较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性，所以用TBS体系，不能用含磷酸根丰富的PBS体系，否则会造成本底偏高。另外，pNPP贮存时间过长由于非酶水解而产生硝基酚和磷酸盐时即可出现这种情况，此时pNPP呈黄色。因此，用于ELISA测定时，pNPP必须绝对五色。pNP的摩尔消光系数（光吸收）的变化取决于溶液的pH及温度、离子强度、蛋白含量，当温度从15~C升高至45℃时，pNP在入＝405 nm处的光吸收将增加5%～7%。实验准备：包被buffer：0.1M NaHCO3 (pH9.6)，4℃贮存。显色液：1. 0.1M glycine pH 10.4 + 1mM MgCl2 + 1mM ZnCl2 配方：7.51g glycine + 203 mg MgCl2 + 136 mg ZnCl2 + 980 ml H2O，用浓NaOH溶液调至pH10.4，补水定容到1L。2. 1 M diethanolamine(二乙醇胺)pH 9.8+ 0.5mM MgCl2，配方：97 ml of diethanolamine +100 mg MgCl2 + 800 ml H2O，用浓HCl溶液调至pH9.8，补水定容到1L。显色液中pNPP终浓度为1mg/ml。终止液：3M NaOH。实验步骤： 1. 包被：用包被液稀释靶分子，4℃过夜或者37℃ 2h。TBS洗3次。 2. 封闭：2%M-TBS 37℃ 1h。TBS洗3次。3. 结合：将AP标记的抗体加入到孔中，37℃ 1h。0.5%TBST洗3次。4. 显色：将显色液加入到孔中，3M NaOH终止(100ul显色液+25ul终止液) 1h以内读数。两种显色液显色时间有区别，显色液1显色较慢，适合检测表达量较高或结合活性高的样本，同时实验平行性较好;显色液2显色较快，灵敏度较高。
