一直在做心脏蛋白方面分子实验，方法是Western Blot，遇到的最大问题是内参不齐。向各位大侠求救！蛋白提取方式是：直接在深麻醉状态剪下心脏，不取血不灌流，PBS中漂洗余血，以最快速度取其中一块，液氮速冻后-80℃保存（全过程3分钟），保存时间从3个月到半年不等。lysis buffer用前加入PMSF和PPi，以每20mg：500μl 裂解液的比例进行玻璃匀浆器手动冰上匀浆。然后3-3-3超声裂解，冰上静置半小时后，12,000*rpm 10分钟，取上清。由于灌注的是缺血缺氧对心肌蛋白的影响，而且要做染色关注冠脉，所以一开始没有灌流的步骤，怕有影响。所以到此步发现上清深浅不等，有的偏红，有的色浅。随后BCA蛋白定量，蛋白浓度好，在标准曲线量程内，曲线R2>0.99，然后混样变性，上样量根据实验目的不同，从30μg到150μg均尝试过。内参选择GAPDH，因为心肌无法使用骨架蛋白作为内参，但GAPDH始终不齐。至此，有以下几个问题：1、不灌流是否真的有必要？2、含血的组织进行BCA定量，得到的结果受血红蛋白的“红色”影响吗？3、红细胞中有GAPDH吗？红细胞也是以GAPDH作内参吗？是否含血量不同的时候，GAPDH就失去了内参意义？The end。希望大家多多指教！
