1、如果能有相关的文献或资料参考,估计会相对比较简单。
2、条件摸索
a、样品性质
主要了解化合物的结构、分子量、pKa、UV、样品浓度范围、溶解度等。
b、色谱柱选择
样品能溶于水-有机混合液的大多数样品(特别是中性或非离子化合物),可以选择反相HPLC,流动相选择水-有机溶剂,色谱柱可以选择C18、C8、TMS、苯基、氰基。一般C18用得比较多。
样品为离子或可电离的化合物(特别是碱性或阳离子样品),可以选择离子对HPLC,流动相选择水-有机溶剂,控制pH的缓冲液和离子对试剂,色谱柱可选择C18、C8、氰基。一般C18用得比较多。
若反相或离子对HPLC无效时,或样品不溶于水-有机混合液。可以选择正相HPLC体系。流动相选择有机溶剂混合液,色谱柱选择氰基、氨基、硅胶、二醇基。
c、初始分离条件(相对较好的首要选择、等度)
色谱柱:150X4.6mm、5um、固定相为C18或C8
流动相:缓冲液-乙腈,缓冲液可选择纯水或缓冲盐(浓度10~30mM)(若中性样品,无需使用缓冲盐)并用酸碱调控pH(如果pH小于2.5,建议选择pH稳定的色谱柱,避免固定相流失),乙腈起始比例可以选择80~100%。
离子对等添加剂,开始时请不要使用。流速1.0~2.0ml/min,柱温35~40℃。
样品:(最好以流动相溶解样品)进样体积小于25uL,进样量小于100ug。
d、液相方法基本目标
分离度:R大于1.5
分离时间:5~10min较理想
定量:RSD小于2%
压力:基本要求小于200bar(20M)
针对基本目标,按实际情况进行调整,譬如流动相实际组分比例,缓冲盐浓度及pH,柱温,梯度等。