对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷常用作β-D-葡糖苷酶的底物，本文将探讨对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷在相关领域的具体应用，展示其在推动科研进步和解决实际问题上的潜力。
简述：对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)，英文名称：4-nitrophenyl-β-D-galactoside，CAS：3150-24-1，分子式：C12H15NO8，外观与性状：白色至淡黄色结晶粉末。对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷通常用作β-D-葡糖苷酶的底物。
应用：
1. 关于Leifsonia菌β-葡萄糖苷酶（Lf18920）
王茜等人报道了克隆表达一种赖氏菌（leifsonia spp. ZF2019）的一个GH3家族糖苷酶基因（Lf18920），以 pET-28a-HMT为载体构建了表达质粒，在大肠杆菌BL21中诱导表达，用Ni-NTA柱纯化表达蛋白。该酶与4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl beta-D-glucopyranoside，pNPG）的亲和力最强，对底物pNPG的特征常数Vm ax和Km分别为0.155U/mg和1.97 mmol/L。
1.1 关于4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷参与的一些实验过程为：
（1）酶底物特异性研究
向酶反应体系中加入不同的底物（pNPG、oNPG、pNPX、ɑ-pNPG、pNP-Nag），置于最适条件下通测定葡萄糖或pNP的生成量。
（2）酶促动力学
用最适pH的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的pNPG底物，加入适宜浓度的酶液，最适温度下测定其吸光度值。计算出最大速度Vmax、米氏常数K m值。
1.2 结果：
（1）底物特异性
由于HMT-18920酶为β-葡萄糖苷酶，而 β-葡萄糖苷酶对底物的特异性广泛，通过酶水解pNPG、oNPG、pNPX、α-pNPG、pNP Nag等底物来确定此酶的底物专一性。根据研究 （如表1）显示：该酶对pNPG的活性最高，对其他底物的水解作用都较小，因此，HMT-18920 酶对底物pNPG有高度的专一性。
（2）酶促动力学分析
以不同浓度的pNPG为底物在pH5.0和40 ℃条件下反应5min，得到pNPG为底物时的动力学方程结果如图9所示。通过双倒数作图法可求得，HMT-18920酶的Vm ax为0.155 mmol/（L·min），Km为1.97 mmol/L。
2. 关于黑曲霉3.316β-葡萄糖苷酶
β-葡萄糖苷酶属于纤维素酶系中的限速酶。为了研究酶解过程中底物与酶的连接方式和找到β-葡萄糖苷酶的最适底物，侯林燕等人以来源于黑曲霉3.316（Aspergillus niger 3.316）的β-葡萄糖苷酶为研究对象，通过对3种底物的分子对接了解对接结构，并测定动力学参数进行试验验证。动力学参数表明，纤维二糖为底物时的催化速率和最大反应速率最大，而4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷与β-葡萄糖苷酶的亲和力最强。该研究找到了β-葡萄糖苷酶的合适底物，并发现影响催化效率和催化速率的原因可能是H-π共轭，这为β-葡萄糖苷酶的后期分子改造提供了一定的参考价值。
3. 关于β-葡萄糖苷酶bgl2238
唐乐丽等人利用宏基因组文库方法,通过功能筛选法从文库中筛选到一个新型β-葡萄糖苷酶基因bgl2238(GenBank:KU320675.1),对新基因进行生物信息学分析和原核表达,并研究其酶学性质。结果表明,该基因全长2238 bp,可编码745个氨基酸,通过氨基酸序列分析,预测bgl2238蛋白分子质量为80.67 kDa,pI值为4.95,是一种结构较稳定、疏水性高且无信号肽序列的酸性蛋白质;经同源性分析,发现其与来源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶具有58%的相似性,属于GH3超家族和GH3C超家族酶.将重组质粒pET-32a(+)-bgl2238转化入Escherichia coli BL2l(DE3)细胞进行异源表达,酶学性质测定结果显示,以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,β-葡萄糖苷酶bgl2238最适反应pH值和温度分别为6.10、44℃,此时该酶最大比活力达到29.1 U/mg;且在4~50 ℃范围内,热处理β-葡萄糖苷酶bgl22384 h后仍保留70%以上的酶活力,热稳定性较好;其动力学参数Vmax为576 μmoL/(L·min),Km为0.296 mmol/L。bgl2238具有良好的酶学性质,可以尝试应用于工业上纤维素降解的生产。
参考文献：
[1] 王茜,许光治. Leifsonia菌β-葡萄糖苷酶(Lf18920)的酶学性质研究及对藏红花素转化作用的初步研究[J]. 中国食品添加剂,2023,34(2):11-18. DOI:10.19804/j.issn1006-2513.2023.02.002.
[2] 侯林燕,朱凤妹. 黑曲霉3.316β-葡萄糖苷酶底物亲和性研究[J]. 食品研究与开发,2021,42(7):171-176. DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2021.07.027.
[3] 唐乐丽,王晓萌,吴秀玲,等. 宏基因组文库新型β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及酶学性质分析[J]. 食品科学,2018,39(4):118-124. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201804018.
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