我现在所做的实验内容是，采用脂多糖刺激巨噬细胞株RAW264.7，采用一定浓度的LPS刺激48h，浓度分别为20ng/ml；30 ng/ml；40 ng/ml；60 ng/ml；80 ng/ml；100 ng/ml；120 ng/ml；160 ng/ml；200 ng/ml，准备到预定时间检测巨噬细胞的iNOS活性。
以前做实验时，没有什么问题，效果还好；
现在在接种板子时，发现LPS刺激巨噬细胞后8小时左右，巨噬细胞出现裂解现象，裂解都位于24孔板每个孔的中央，周边尚有正常的巨噬细胞；18个孔为LPS刺激孔，两个孔为只加DMEM高糖培养基的对照孔，总共20个孔，都出现了裂解现象，只是两个对照孔裂解程度低一些。
操作步骤为：先把巨噬细胞接种到24孔板中，每孔1ml，细胞浓度为4×105/ml。培养基为无FCS的DMEM高糖，里面含有浓度为1%的双抗，然后细胞同步化12h，接着添加配置的LPS液。
巨噬细胞第一次出现裂解现象时，巨噬细胞已传代过了20代，自己怕是巨噬细胞传代过久，活性变差；后来新买了巨噬细胞，依旧裂解。
脂多糖的型号是来自大肠埃希杆菌055：B5的LPS类。第一次出现裂解时，当时的脂多糖用了一个多月，自己怕脂多糖过期导致细胞裂解，后来新买的脂多糖刺激巨噬细胞，依旧是从孔的中央出现裂解现象。
培养基采用的是DMEM高糖，也重新买了，细胞依旧裂解；
24孔板是采用COSTAR的一次性耗材；加液枪头是国产的，消毒后使用。
这些巨噬细胞在一次性COSTAR培养瓶培养时，状态都还不错，第一批的巨噬细胞贴壁能力差了些，容易被细胞挂子挂下来；后来新买的巨噬细胞贴壁能力很好。
巨噬细胞传代时，都采用一次性细胞挂子从培养瓶中挂下来的，不是采用胰酶消化。
比较奇怪的地方有两点：
同样的条件，培养瓶中的传代的巨噬细胞生长良好；
同样处理的巨噬细胞，接到另一24孔板中，该24孔板中包含9个IL-4刺激样本；5个LPS刺激样本（对照用）；3个仅含无FCS的DMEM高糖培养基（对照用）。在采用第一批巨噬细胞做实验时，出现过一次裂解现象；后来换用新的巨噬细胞后，IL-4组（浓度为30ng/ml）；LPS刺激组（浓度为30ng/ml）；以及仅含DMEM刺激组都没有出现裂解。
两个24孔板中添加的LPS来自同一母液；添加的DMEM高糖培养基来自同一次所配制的，经过滤器过滤。
连续接种了6个24孔板，均出现裂解，导致检测iNOS活性的实验完全停止，自己万分着急；希望有高人来点拨一二，感激不尽！
