各位高手，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000 bp的片段，通过BamH1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下：
1. 通过LA Taq酶扩增，并纯化回收目的片段（引物中带有酶切位点，保护性碱基＝3，上游带有Kozak序列）；由于回收效率很高，所以在进行下一步双酶切时只加了12 μl的目的片段，H2O 20 μl，10 X K BUFFER 4 μl，两种酶各2 μl，37℃作用过夜（12-14 h），再进行胶回收。2. 载体pcDNA3.1提取质粒后，也按照以上的体系进行双酶切，时间为6 h。3. 将酶切后的木点片段和载体均取2 μl进行电泳，结果显示大小与预期相符，亮度相近。4. 连接时，目的片段：载体=4--10：1（因亮度相近，所以按照体积比）都做过，10 μl体系和15 μl体系都尝试过。5. 感受态为新制备的JM109，转化效率没有具体测过但别人用后均连接成功，阳性质粒眼观转化效率很高。
6. 限制性内切酶为TAKARA，T4连接酶是国内一家小公司的产品，不过实验室一直用，效果一直有保证，同期进行连接的其他同学也都连接成功。
结果：
转化后，平板上均有数量不等的菌落产生，少时4-5个，多时10来个。摇菌扩增8 h，进行菌液PCR检测（含阳性对照），检测组无阳性结果，但一直在1000 bp左右出现较弱条带，阳性组正常。提取质粒后，10 μl体系双酶切2 h，竟然在2000 bp和3000 bp处出现较弱条带（比Marker稍暗）。
特此悬赏10个叮当，请高手指点迷津。
如果有效果好的、适于长片段连接的方法，也请大家指教，多谢。
