奶粉中三聚氰胺的测定方法gb/t 22388—2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法determination of melamine in raw milk and dairy products1 范围本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液相色谱法（hplc）、液相色谱-质谱/质谱法（lc-ms/ms）和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法（gc-ms），气相色谱-质谱/质谱法（gc-ms/ms）]。本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定；液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱（包括气相色谱-质谱/质谱）法同时适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定性确证。本标准高效液相色谱法的定量限为2 mg/kg，液相色谱-质谱/质谱法的定量限为0.01 mg/kg，气相色谱-质谱法的定量限为0.05 mg/kg（其中气相色谱-质谱/质谱法的定量限为0.005 mg/kg）。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。gb/t 6682 分析实验室用水规格和试验方法第一法高效液相色谱法（hplc）3.1 原理试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。3.2 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。3.2.1 甲醇：色谱纯。3.2.2 乙腈：色谱纯。3.2.3 氨水：含量为25％～28％。3.2.4 三氯乙酸。3.2.5 柠檬酸。3.2.6 辛烷磺酸钠：色谱纯。3.2.7 甲醇水溶液：准确量取50 ml 甲醇和50 ml 水，混匀后备用。3.2.8 三氯乙酸溶液（1％）：准确称取10 g 三氯乙酸于1 l 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。3.2.9 氨化甲醇溶液（5％）：准确量取5 ml 氨水和95 ml 甲醇，混匀后备用。3.2.10 离子对试剂缓冲液：准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 ml 水溶解，调节ph 至3.0 后，定容至1l 备用。3.2.11 三聚氰胺标准品：cas 108-78-01，纯度大于99.0%。3.2.12 三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 ml 容量瓶中，用甲醇水溶液（3.2.7）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/ml 的标准储备液，于4℃避光保存。3.2.13 阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 ml，或相当者。使用前依次用3 ml 甲醇、5 ml 水活化。3.2.14 定性滤纸。3.2.15 海砂：化学纯，粒度0.65 mm～0.85 mm，二氧化硅（sio2）含量为99％。3.2.16 微孔滤膜：0.2 μm，有机相。3.2.17 氮气：纯度大于等于99.999％。3.3 仪器和设备3.3.1 高效液相色谱（hplc）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。3.3.2 分析天平：感量为0.0001 g和0.01 g。3.3.3 离心机：转速不低于4000 r/min。3.3.4 超声波水浴。3.3.5 固相萃取装置。3.3.6 氮气吹干仪。3.3.7 涡旋混合器。3.3.8 具塞塑料离心管：50 ml。3.3.9 研钵。3.4 样品处理3.4.1 提取3.4.1.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等称取2 g（精确至0.01 g）试样于50 ml具塞塑料离心管中，加入15 ml三氯乙酸溶液（3.2.8）和5 ml乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 ml，移取5 ml滤液，加入5 ml水混匀后做待净化液。3.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等称取2 g（精确至0.01 g）试样于研钵中，泵出口的止回阀旁通有没有必要 加入适量海砂（试样质量的4倍～6倍）研磨成干粉状，转移至50 ml具塞塑料离心管中，用15 ml三氯乙酸溶液（3.2.8）分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5 ml乙腈，余下操作同3.4.1.1中“超声提取10 min，……加入5 ml水混匀后做待净化液”。注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用spe柱净化。3.4.2 净化将3.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱（3.2.13）中。依次用3 ml水和3 ml甲醇洗涤，抽至近干后，用6 ml氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 ml/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 ml流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜（3.2.16）后，供hplc测定。3.5 高效液相色谱测定3.5.1 hplc 参考条件a) 色谱柱：c8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者；c18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者。b) 流动相：c8柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙腈（85+15，体积比），混匀。c18柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙腈（90+10，体积比），混匀。c) 流速：1.0 ml/min。d) 柱温：40℃。e) 波长：240 nm。f) 进样量：20 μl。3.5.2 标准曲线的绘制用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80 μg/ml 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品hplc 色谱图参见附录a 中的图a.1。3.5.3 定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。3.5.4 结果计算试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得：式中：x —— 试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；a —— 样液中三聚氰胺的峰面积；c —— 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；v —— 样液最终定容体积，单位为毫升（ml）；as —— 标准溶液中三聚氰胺的峰面积；m —— 试样的质量，单位为克（g）；f —— 稀释倍数。3.6 空白实验除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。3.7 方法定量限本方法的定量限为2 mg/kg。3.8 回收率在添加浓度2 mg/kg～10 mg/kg浓度范围内，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差小于10%。3.9 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
