重组蛋白分为冻干粉和溶液态两种保存形式，原核细胞表达的重组蛋白为冻干粉状态，真核细胞表达的重组蛋白为溶液态保存，这样使得重组蛋白非常稳定，在 -80℃ 条件下可保存数年。 冻干粉在使用前需进行溶解，其中溶解的方法非常关键，因为溶解不好会降低蛋白的效用。 溶液态保存的重组蛋白在冻融稀释使用过程中也需要仔细注意，这些都是用户在实际应用中经常遇到的问题。 （1）原核细胞表达的重组蛋白。 大肠杆菌表达的冻干重组蛋白，已经从包涵体中提纯，添加了蛋白保护剂，使用过滤后的无菌水作为复溶剂即可，复溶冻干蛋白 100ug，用 86ul 的超纯水，轻轻摇晃使蛋白溶解，再用移液枪的枪头轻吹几下即可完全溶解，一定不能使用涡旋仪进行快速振荡或剧烈摇晃。 （2）真核细胞表达的重组蛋白。有活性的蛋白质不仅要转录和翻译，还要进行翻译后的加工，使得蛋白质的空间折叠方式维持正常，所以重组蛋白必须在真核细胞中进行，如哺乳动物细胞能够识别和去除基因中的内含子，对翻译后的蛋白质进行加工，这样表达的蛋白质具有生物活性。我们用溶液态来保存，保持了其良好的活性和稳定性。 （3）重组蛋白的保护剂。在冻干和储存过程中常用的保护剂或稳定剂有糖类，多元醇，聚合物，表面活性剂，某些蛋白和氨基酸等。我们通常加 8%（质量比体积）的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集，甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂。 ...

防止PCR反应污染的方法： (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。 (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 (三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 (四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。 (五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。 (六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。 (七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。 ...

基本原理： ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 注意事项： 1、操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度(保持在18 C~25℃)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。 2、正确使用加样器加样器应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，否则可导致结果错误，实验重复性差。 3、手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要使洗液在孔间窜流，造成孔问污染，导致假阴性或假阳性。 4、要保证加液量一致 我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好，滴瓶不易控制加液量不准，造成显色不统一，判断错误。 5、显色液量不可过多 加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。 6、试剂的影响因数:应选用有*批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。试剂应妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。 ...

聚合酶链式反应 (PCR) 是分子生物学领域功能强大的技术之一。影响引物和探针的稳定性的主要因素是储存温度、储存时间、是否被长时间暴光、储存的引物和探针的浓度以及储存溶液的组分。 长期保持引物和探针的稳定性的关键有四点： 1 、低压冻干的引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。引物一旦重新溶解，即应置于 -20 ° C 保存，且若保存时间超过一年则应对其进行监测，看它是否出现功能下降。 2 、对于标记的引物和探针，则应采取措施避免标记物暴光 ( 例如使用不透明管及置于暗处保存 ) ，以延长它们的使用寿命。 3 、引物浓度也可影响其稳定性。建议引物的储存浓度不低于 10 μ M ；实际上，在大多数情况下， 100 μ M 的引物浓度操作更简单。引物和探针还应分装保存，以减少冻融次数，特别是标记的引物和探针。 4 、最后， TE 缓冲液可形成比水更为稳定的环境。此外，含有 0.1 mM EDTA 的 TE 缓冲液 ( 标准 TE 中含有 1 mM EDTA) 是一种理想的溶液，这是由于一些 PCR 反应对 EDTA 的灵敏度可能有一些残存。 ...

酶联免疫吸附实验 （ ELISA ） 因其操作简单，灵敏度高，特异性好，经济安全等特点而在临床上广泛应用，但是由于其操作步骤复杂，一般包括试剂准备，样本收集，加样，温育，洗涤，显色，比色，结果判定等，其中任何一项操作不当都会对检测结果产生很大影响。因此，必须加强 ELISA 检测的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。下面对ELISA标本质量如何控制分析： 1 、 ELISA 试剂盒要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以 HRP 为标记酶的 ELISA 试剂盒测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的 HRP 底物反应显色。 2 、 标本 的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β - 半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 3 、血清标本如是以无菌操作分离，则可以在 2 ～ 8 ℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在 -70 ℃以下。 4 、冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。 ELISA 试剂盒标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 5 、标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 Elisa 试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。 ...

正确的洗涤和冲洗方案尤其重要。在下游分析过程中，不充分、不一致和/或过度清洗会造成问题。有许多洗板的方法，包括使用自动洗板机、手动分流器或洗瓶。当手动吸出孔中的液体时，要注意不要碰到孔的底部 -- 吸管的尖端应该放在孔的一侧。为了减少背景信号，清洗量需要足够大，以去除孔中未结合的样品和试剂。然而，过度洗涤会减少目标信号。 确保所有的孔都被平均清洗，以避免在整个检测板上引入信号变化。要做到这一点，如果是手工清洗，请检查移液器吸头是否固定好，如果使用自动洗板机，所有分配和吸液的喷头必须没有堵塞。你可以在空板上测试它们，以检查它们是否同样工作。 1. 如果使用自动洗板机或多通道移液器，请确保进出口能正常运作。 2. 最后一次洗涤后，翻转酶标板倒出多余的洗涤液，并在吸水纸上拍干液体。洗板太快或太慢都会降低精确度。不能让孔内液体自然风干，需立即进行下一步操作。 3. 按照说明书，添加足量的洗涤液至孔内，并保证洗涤完全。 4. 由于洗涤液不是通用的，当试剂盒内的洗涤液用完时，请不要使用其他试剂盒中的洗涤液。如有需要，可联系技术支持寻求帮助。 5. 不要减少洗涤时的浸泡时间或跳过浸泡的步骤。 6. 按照说明书上的洗涤次数清洗，随意改变洗涤的次数会影响实验的精确性。 ...

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。   温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。   ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。   ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：      Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)      复性温度=Tm值-(5～10℃)   在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。   ③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：            70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子            70℃ 60核苷酸/S/酶分子            55℃ 24核苷酸/S/酶分子            高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。   PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。   循环次数  循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 ...

ELISA间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： 1、将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2、加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 3、加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 4、加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 ...

标准物质 的制备是一个关键的过程，确保其质量和可追溯性。下面是标准物质的制备一般步骤：   1、确定目标物质和纯度要求：确定所需的目标物质以及其纯度要求。这可能涉及从商业供应商购买纯品，从自然来源提取物质，或者通过化学合成等方式制备目标物质。   2、基于定量分析方法：建立适当的定量分析方法，以确保目标物质的含量可以准确地测量。这通常涉及使用已知浓度的标准物质进行校准和验证。   3、制备溶液或混合物：根据定量分析方法，准备目标物质的溶液或混合物。这可能包括将目标物质溶解于适当的溶剂中，并按照特定的配比混合。   4、纯化和分离：如果目标物质需要纯化或分离，可采用各种技术，如结晶、萃取、色谱等。这些步骤有助于提高目标物质的纯度并去除杂质。   5、分装和包装：将制备好的标准物质分装到适当的容器中。这些容器通常是气密密封的，以保持标准物质的稳定性和防止污染。   6、认证和验证：对制备好的标准物质进行认证和验证，以确保其符合预定的纯度和含量要求。这包括使用已知浓度的标准物质进行比对，进行精确的定量分析，以确保制备的标准物质的准确性和可追溯性。   7、标签和文档：为制备好的标准物质添加正确的标签和文档，包括目标物质的名称、纯度、溶液浓度、有效期限、储存条件和安全注意事项等信息。   8、储存和保管：将制备好的标准物质储存和保管在适当的条件下，以确保其稳定性和持久性。这可能包括在低温、干燥或光线受限的环境中储存，并采取适当的防护措施以避免污染或降解。   9、制备标准物质需要严格的实验操作和控制，确保其质量、可追溯性和稳定性。每个制备过程可能会因所需的目标物质和特定的分析要求而有所不同。因此，在制备过程中应根据具体情况和所需标准遵循相应的实验操作和质量控制规程。 ...